Combinaison de la microscopie de compensation et de fluorescence pour visualiser les changements dans l’expression génique et les réponses physiologiques à Plasmodiophora brassicae

Plasmodiophora brassicae est l’agent pathogène biotrophe obligatoire du sol qui attaque les plantes de la famille des Brassicaceae. Lors de l’infection, l’agent pathogène déclenche le développement de galles sur les parties souterraines de la plante, d’où le nom de la hernie de la maladie. Le développement des galles s’accompagne d’une reprogrammation très complexe.

Par conséquent, la possibilité de suivre les changements internes au cours de la maladie est cruciale pour comprendre cette interaction plante-pathogène. Notre protocole améliore l’imagerie des galles complexes, épaisses et biliaires. Il facilite la visualisation des changements dans l’expression des gènes, les réponses physiologiques, l’équilibre phytohormonal, la progression de la maladie, la distribution des spores et la lignification locale.

Le protocole préserve les protéines fluorescentes dans les échantillons, ce qui permet le stockage et le traitement des objets sur une longue période. Il permet également de suivre les changements biochimiques et structurels accompagnant la progression de la maladie. La procédure sera présentée par Sara Blicharz, chercheuse postdoctorale dans notre groupe, Deeksha Singh, doctorante de notre laboratoire, et Kornel Michalak, doctorant du groupe du professeur Agnieszka Bagniewska-Zadworna à l’Université Adam Mickiewicz.

Commencez par préparer le tissu végétal. Enlevez soigneusement la terre des systèmes racinaires des plantes infectées et non infectées par la hernie. Nettoyez soigneusement avec de l’eau et recueillez les hypocotyles et les galles dans des tubes microcentrifugeux.

Fixer les échantillons dans 200 à 500 microlitres de fixateur de paraformaldéhyde pendant une heure à température ambiante en appliquant un vide constant de 700 millibars à l’aide d’une pompe à vide. Assurez-vous que l’objet est complètement immergé dans la solution de paraformaldéhyde. Utilisez 4%agarose pour incorporer des hypocotyles non infectés et des galles infectées.

Faites bouillir la solution pour dissoudre l’agarose et versez-la quand elle refroidit alors qu’elle est encore visqueuse. Sécher légèrement l’objet sur un mouchoir en papier pendant quelques secondes pour éliminer l’excès de paraformaldéhyde. Utilisez des cure-dents ou des forceps pour encastrer et orienter soigneusement l’objet végétal dans l’agarose.

Pour éviter les sections obliques, assurez-vous que l’objet est orienté et moulé correctement afin que son axe soit perpendiculaire au plan de la lame du vibratome. Pour accélérer la solidification de l’agarose, placez une plaque de Petri ou multiculture à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. À l’aide d’une lame, coupez et moulez soigneusement l’objet dans un bloc d’agarose, en notant l’orientation préférée pour la section.

Collez le bloc d’agarose ou le gros galle pour le monter correctement sur le porte-échantillon à l’aide de cyanoacrylate ou de colle instantanée et de ruban de masquage. Ajustez l’épaisseur des sections, la vitesse et l’amplitude des vibrations en fonction de l’épaisseur et de la taille de la galle. Ajouter de l’eau distillée au bain-marie et commencer par la section.

Prélever soigneusement les sections à l’aide d’une pince ou d’une brosse et les transférer dans un tube microcentrifuge contenant un millilitre de tampon PBS 1X. Retirez 1X PBS du tube microcentrifuge et ajoutez 200 à 500 microlitres de solution de dégagement. Remplacez la solution de nettoyage par la nouvelle si sa couleur change après un certain temps pendant le traitement de l’échantillon.

Effectuer une coloration blanc de calcofluor pour les parois cellulaires des cellules végétales en préparant 5% de coloration blanc de calcofluor dans la solution de nettoyage. Ensuite, colorez les cellules dans l’obscurité pendant au moins cinq minutes. Colorer les lipides avec du rouge du Nil et des lignines avec coloration basique à la lignine Fuchsin comme décrit dans le manuscrit du texte et monter les sections dégagées sur la lame de microscopie.

Ensuite, observez les cellules sous une épifluorescence ou un microscope confocale. Utilisez plusieurs modes d’acquisition pour imager plus d’un spectre de fluorescence simultanément. La dynamique de la maladie et l’accumulation d’agents pathogènes ont été suivies dans les galles colonisées par Plasmodiophora brassicae, et de grandes cellules avec des spores au repos de P. brassicae ont été observées après coloration rouge du Nil.

Les changements dans la différenciation du xylème lors de l’infection à P. brassicae ont été visualisés à l’aide de la coloration de base de Fuchsin. Les plantes d’Arabidopsis hébergeant la construction pHCA2:erRFP ont été utilisées pour visualiser l’expression du gène HCA2 dans le tissu phloème dans les galles de la hernie. HCA2 a co-localisé avec le phloème dans les derniers stades du développement de la galle induite par P. brassicae, et l’activité des gènes a reflété le mécanisme par lequel P. brassicae augmente la complexité du phloème.

16 jours après l’inoculation, les réponses cytokinines différentielles entre les plantes infectées et non infectées ont été évaluées en vérifiant l’expression du marqueur TCS:GFP dans les galles en développement. Les réponses cytokinines semblent être significativement diminuées dans les galles infectées, alors qu’elles sont restées fortes, en particulier dans le bassin de phloèmes, chez les plantes non infectées. La plupart des étapes critiques sont la fixation dans le PFA, l’incorporation et la section.

Pour la section des vibratomes, il faut optimiser et ajuster soigneusement les paramètres de vitesse, d’amplitude et d’épaisseur pour obtenir des sections de bonne qualité. Les techniques de sectionnement des vibratomes et de nettoyage des tissus ont ouvert la voie à l’amélioration de l’analyse microscopique des réponses physiologiques lors des interactions plantes-microbes et des tissus présentant une croissance secondaire avec une anatomie cellulaire complexe.