Évaluer la motilité Neural Stem Cell utilisant un gel d'agarose à base dispositif microfluidique
11 février 2008
Nous démontrons que la surexpression du facteur de croissance épidermique récepteurs (EGFR) améliore la motilité des cellules souches neurales (NSC) en utilisant un roman sur gel d'agarose dispositif basé microfluidique. Cette technologie peut être facilement adaptable à d'autres systèmes cellulaires de mammifères où les sources de cellules sont rares, telles que des cellules souches neurales, et le tour autour du temps est critique.
Bonjour, je suis Kevin Won. Je suis étudiant en master de génie à la Biofluids Lab de l'université Cornell. Aujourd'hui, je vais parler de l'utilisation d'un dispositif microfluidique à base d'agros pour étudier l'effet du facteur de croissance épidermique EGF sur les cellules souches neurales murines.
Le dispositif se compose essentiellement de trois canaux microfluidiques, chacun mesurant 150 micromètres de large. L'EGF est injecté dans l'un des canaux latéraux et le tampon est injecté dans l'autre canal latéral. Cela établit fondamentalement un gradient chimique linéaire statique à travers le canal central.
Étant donné que l'EGF diffuse facilement à travers le gel d'agarose, les cellules souches neuronales sont ensemencées dans le canal central et la progression de leur migration est surveillée au microscope. Ainsi, les dispositifs sont essentiellement constitués d'une couche supérieure en plexiglas qui possède toutes les entrées et sorties permettant la connexion aux tubulures. En dessous se trouve une membrane en gel d'agarose, contenant quatre dispositifs dessinés.
Ceci est entouré par un espaceur en PDMS, ce qui garantit une épaisseur constante sur l'ensemble du dispositif. Le PDMS et le gel sont assemblés sur une lame de verre, qui est revêtue d'ect. Cela aide les cellules à adhérer à la lame de verre.
En outre, la plaque en acier inoxydable sert à monter l'ensemble du dispositif, et nous assemblons celui-ci en sandwich à l'aide de vis. La lignée cellulaire de type sauvage a été transfectée avec un vecteur rétroviral afin de surexprimer le récepteur EGF de type sauvage, et la lignée cellulaire delta a été transfectée avec une version mutée du récepteur EGF qui lui permet d'être activé de manière constitutive, sans le ligand EGF. Bon, je vais commencer par expliquer le processus d'assemblage de notre dispositif microfluidique.
J'ai donc d'abord placé l'espacement en PDMS autour des éléments en relief des microcanaux en silicium sur nos matrices. Maintenant, je vais peser 0,3 gramme d'agros. Ensuite, je vais prélever 10 mils de milieu indépendant du CO2 et l'ajouter à l'agros.
Et je vais pipeter de haut en bas pour mélanger la poudre d'agros avec le milieu indépendant du CO2. Maintenant, nous sommes prêts pour le micro-ondes. Comme vous pouvez le voir, l'agros est désormais liquéfié, mais quelques granules subsistent encore.
J'essaierai de remuer doucement pour dissoudre le granulé et éliminer les bulles d'air. Je verse donc l'agarose fondue sur les structures en relief du moule en silicium, puis je prends une lame de verre stérile que je place au-dessus de l'espacement en PDMS. Je la positionne en biais afin de chasser la majorité des bulles d'air présentes dans le gel d'agarose.
Et j'ai appliqué une pression et je continuerai d'appliquer une pression jusqu'à ce que la coquille d'agros se solidifie. Après une à deux minutes, elle est solidifiée. Maintenant, je vais retirer l'excès d'agros de la lame.
L'étape suivante consiste à retirer délicatement la lame de verre, que l'on peut ensuite jeter. Je vais maintenant tenter de transférer délicatement le motif aros sur une lame de verre que j'ai préalablement recouverte de fibronectine. J'utilise essentiellement cette feuille stérile en plastique pour m'aider à soulever le motif agros avec l'entretoise en PDMM MS, puis je transfère le motif agros en orientant les canaux vers le bas, en direction de la lame.
Maintenant que ceci est fermement fixé sur la lame de verre, je vais percer des trous dans les réservoirs individuels afin que le collecteur en plastique ait accès aux canaux. Je vais utiliser un petit perforateur métallique. Nous avons maintenant terminé le perçage des trous dans le dispositif.
J'ajouterai 500 microlitres de milieu indépendant de CO2 afin d'éviter le dessèchement des microcanaux, puis je laisserai reposer pendant une à deux minutes. Bon, après une à deux minutes, j'essaierai d'éliminer l'excès de milieu, puis j'alignerai les orifices découpés dans le motif agros avec les orifices d'entrée et de sortie du collecteur en plexiglas. Une fois les orifices alignés, j'appuie fermement pour former un bon joint.
Je place maintenant le collecteur en plexiglas sur les supports en acier inoxydable, puis je vais délicatement assembler l'appareil à l'aide de vis. Je fais très attention à ne pas trop serrer les vis, car cela écraserait les canaux, et je les insère de manière à tourner dans le sens horaire afin d'empêcher le gel Agros à l'intérieur de se désolidariser. Je vais prélever un millilitre de milieu et utiliserai cette seringue pour tester l'appareil.
Et comme vous pouvez le constater, j'injecte un fluide dans chaque microcanal et je vérifie la sortie du fluide par chaque sortie. Pour l'instant, j'ai placé le dispositif assemblé dans la chambre environnementale du microscope. Celle-ci est maintenue à 37 degrés Celsius, ce qui permet de réchauffer le dispositif et de le préparer en vue du semis des cellules.
Et comme vous pouvez le voir, j'ai déjà passé les deux tubes de la pompe parasol à travers le dispositif. Actuellement, je rince les tubes avec du PBS en prévision de nos expériences. Nous allons donc maintenant installer les tubes.
Je vais passer le tube de la pompe parasol à travers les bouchons déjà percés. Chaque tube comporte un nombre précis d'encoches qui me permet d'identifier l'entrée et la sortie du tube. Ainsi, le tube avec quatre encoches recevra 10 nanogrammes par millilitre.
La solution d'EGF va maintenant fixer le tube au dispositif. Je vais donc le fixer à chaque dispositif selon le nombre d'encoches qu'il possède. Cela correspond à la solution qu'il prélève.
Et maintenant, j'attache le tube de sortie. Nous utilisons un tube en tigon transparent afin de vérifier que le milieu s'écoule bien à travers le tube de sortie et qu'il n'y a pas d'obstruction dans le canal. Et maintenant, je vais démarrer les pompes parasol.
Je vais maintenant commencer la procédure d'ensemencement des cellules dans le canal central. Je vais d'abord retirer le milieu excédentaire dans le canal du capteur. Maintenant, je vais observer les cellules.
Les cellules sont déjà en suspension dans un milieu indépendant du CO2. J'ai prélevé 60 microlitres à l'entrée du canal central et j'ai prélevé 20 microlitres à la sortie. Espérons que les cellules se déposeront par un écoulement dirigé par la gravité.
Et je répéterai cette procédure pour les deux autres canaux sensibles, puis nous observerons maintenant au microscope si l'ensemencement cellulaire a été réussi. Les cellules se sont donc fixées sur la lame de verre et, dans quelques minutes, elles commenceront à s'étaler et adopteront leur morphologie caractéristique. Aujourd'hui, nous avons donc abordé l'assemblage du dispositif lui-même, la préparation des réactifs ainsi que les techniques microscopiques que j'utilise pour imager la migration cellulaire au sein du dispositif.
En conclusion, nous espérons que cet appareil connaîtra une adoption beaucoup plus large, notamment dans le cadre clinique. La figure un est orientée horizontalement. Elle montre les trajectoires des cellules C 17.2 et l'augmentation des concentrations d'EGF en ordonnée.
Il montre les trajectoires des différentes souches de cellules C17.2 que nous avons utilisées dans nos expériences avec la même concentration d'EGF. Les données des cellules parentales montrent un pic de mobilité à un gradient de concentration d'EGF de 10 nanogrammes par millilitre, indiquant que les récepteurs sont saturés par le ligand à une concentration plus élevée d'EGF. Et les données de type sauvage montrent une augmentation de la mobilité à la concentration d'EGF de cent nanogrammes par millilitre.
Cela indique que les récepteurs ne deviennent pas saturés à des concentrations élevées d'EGF. Cela est logique puisqu'ils ont été conçus pour surexprimer le récepteur de l'EGF. Enfin, les données obtenues avec la lignée cellulaire delta montrent que la mobilité des cellules est approximativement indépendante de la concentration en EGF.
On s'attend également à ce résultat, puisque les récepteurs EGF mutés ont été conçus pour être activés indépendamment de la présence d'EGF.
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Aperçu
Cette étude démontre que la surexpression des récepteurs du facteur de croissance épidermique (EGFR) augmente la motilité des cellules souches neurales (NSCs) à l'aide d'un nouveau dispositif microfluidique basé sur un gel d'agarose. Cette technologie peut être adaptée à d'autres systèmes cellulaires de mammifères lorsque les sources cellulaires sont rares.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Microluidique
Contexte
- Le facteur de croissance épidermique (EGF) influence le comportement cellulaire.
- Les cellules souches neuronales (CSN) sont essentielles à la régénération nerveuse.
- Les dispositifs microfluidiques permettent un contrôle précis de l'environnement cellulaire.
- Comprendre la motilité des CSN peut contribuer à la médecine régénérative.
Objectif de l'étude
- Étudier l'effet du facteur de croissance épidermique (EGF) sur la motilité des cellules souches neuronales (NSC).
- Développer un dispositif microfluidique pour l'étude des réponses cellulaires.
- Fournir des informations sur le comportement des cellules souches neuronales (NSC) dans un environnement contrôlé.
Méthodes utilisées
- Développement d'un dispositif microfluidique basé sur un gel d'agarose.
- Création d'un gradient chimique linéaire statique d'EGF.
- Observation de la motilité des cellules souches neuronales en réponse à l'exposition à l'EGF.
- Utilisation de canaux microfluidiques pour un contrôle précis des fluides.
Résultats principaux
- La surexpression de l'EGFR améliore significativement la motilité des cellules souches neurales.
- Le dispositif microfluidique crée efficacement des gradients chimiques.
- Les résultats indiquent des applications potentielles dans les thérapies régénératives.
- Les découvertes peuvent être adaptées aux cellules souches neurales humaines.
Conclusions
- Le facteur de croissance épidermique joue un rôle essentiel dans la motilité des cellules souches neuronales.
- Le dispositif mis au point constitue un outil précieux pour les études cellulaires.
- De futures recherches pourraient s'étendre à d'autres types cellulaires et à d'autres conditions.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La motilité des cellules souches neuronales sert de biomarqueur prédictif du potentiel tumorigène et des troubles du développement, ce qui rend son évaluation quantitative essentielle lors de la validation précoce des cibles. La plateforme microfluidique basée sur un gel d'agarose permet des tests de motilité reproductibles et contrôlés par gradient, qui facilitent l'analyse mécanistique et la réduction des risques associés aux modulateurs de la voie EGFR. Cette approche renforce la confiance dans l'identification des candidats prometteurs en reliant la surexpression des récepteurs à des réponses phénotypiques fonctionnelles dans un système pertinent pour la maladie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier la motilité dépendante du récepteur EGFR comme indicateur fonctionnel de l'engagement de la cible dans les cellules souches neurales.
- Valeur opérationnelle : Offre un microenvironnement contrôlé permettant d'isoler les effets de la signalisation EGFR des variables perturbatrices dans les essais de motilité.
- Valeur prédictive : Facilite le criblage phénotypique de modulateurs de l'EGFR en quantifiant les modifications de la motilité sous des gradients chimiques définis.
Élaboration de tests et criblage
- Prêt-à-l’emploi pour tests : Génère des mesures optiques quantitatives de la mobilité cellulaire compatibles avec une analyse à haut contenu et le criblage de composés.
- Reproductibilité : La fabrication du gel d'agarose assure une géométrie des canaux et des propriétés de diffusion constantes entre les réplicats.
- Extensibilité : Le façonnage multipériphérique sur une seule membrane de gel permet le test parallèle de plusieurs conditions ou lignées cellulaires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Établit un lien entre la motilité des CSM et l'évaluation des facteurs tumorigènes, soutenant des modèles précliniques d'invasion des cellules souches cancéreuses cérébrales.
- Réduction des risques mécanistiques : Précise si la surexpression d'EGFR induit une motilité indépendante du ligand, orientant le choix des cibles pour des stratégies inhibitrices.
- Continuité translationnelle : Permet la comparaison de variants d'EGFR de type sauvage, surexprimés et activés de manière constitutive afin de prédire les profils de réponse clinique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
L'appareil s'intègre dans le continuum de la découverte, allant du test d'hypothèses sur la cible à l'optimisation du composé candidat, en fournissant des données phénotypiques fondées sur la mobilité qui éclairent les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin avant tout investissement préclinique.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur le rôle de l'EGFR dans la motilité des cellules souches neurales grâce à un contrôle précis des gradients et à une imagerie en temps réel.
- Criblage : Fournit des données quantitatives normalisées sur la motilité, permettant la comparaison de composés modulant l'EGFR ou de variants génétiques.
- Analyse : Génère des paramètres basés sur les trajectoires, facilitant la comparaison statistique de la motilité selon différentes conditions et lignées cellulaires.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les observations de motilité in vitro et leur pertinence pathophysiologique dans les modèles de développement neural et de cancer cérébral.
- Réutilisation en milieu industriel : La plateforme à base de gel d'agarose peut être adaptée à d'autres types de cellules mammales, favorisant une standardisation transversale des essais fondés sur la motilité.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la signalisation de l'EGFR en associant l'état du récepteur à des phénotypes fonctionnels de mobilité.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité des tests grâce à une fabrication standardisée des gels et à la génération de gradients par perfusion latérale.
- Valeur stratégique : Améliore la priorisation des cibles en fournissant une validation fonctionnelle allant au-delà des tests de liaison ou d'expression.
- Impact sur le portefeuille : Permet une progression ajustée au risque des candidats ciblant l'EGFR, fondée sur une dé-risquisation phénotypique guidée par la mobilité.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en assemblage de microfluidique, en manipulation de gels d'agarose et en imagerie de cellules vivantes sous perfusion contrôlée.
- Dépend de l'accès à des pompes de perfusion, à des chambres environnementales et à des microscopes inversés pour le suivi du mouvement en enregistrement temporel.
- Exige une standardisation de la densité d'ensemencement cellulaire et de l'épaisseur du gel afin d'assurer des gradients de diffusion et une adhésion reproductibles.
- Implique des adaptations selon les types cellulaires, en fonction de leurs propriétés d'adhésion et de leurs caractéristiques de motilité sur des surfaces revêtues de fibronectine.
- Est limité par l'accessibilité optique de la matrice de gel et par une autofluorescence potentielle qui peut affecter certains signaux basés sur la fluorescence.
