Analyse comparative de la structure de l’ARN des transcrits naissants et matures chez Saccharomyces cerevisiae

Nous avons étudié le traitement cotranscriptionnel de l’ARN, ce qui inclut la façon dont l’ARN naissant se replie à partir de l’ARN polymérase qui le synthétise. Avant cette méthode, nous n’étions pas capables de surveiller comment l’ARN se replie pendant la synthèse, ce qui freinait nos recherches. Cette nouvelle méthode permet donc de combler ces lacunes.

CoSTseq a été développé pour étudier le repliement naissant de l’ARN chez la levure. Il est particulièrement efficace pour analyser des ARN très abondants. Pour commencer, inoculez la souche BY4741 de Saccharomyces cerevisiae dans 50 millilitres de milieu YPAD et incubez à 30 degrés Celsius avec un secouement à 200 tours par minute jusqu’à ce que la culture atteigne la phase diagramme moyenne.

Collectez environ trois millilitres de culture de levure correspondant à 1,8 unité de densité optique et centrifugez à 2 500 x g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius à l’aide d’une centrifugeuse pré-refroidie. Jetez le surnageant dans un récipient à déchets. Reposez la pastille dans 10 millilitres de PBS froid et centrifugez à nouveau à 2 500 x g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.

Retirez le surnageant et gardez la pastille de levure sur la glace. Resuspendez soigneusement la pastille de levure dans 10 millilitres de sarkosyl froid à 0,5 % sans créer de bulles. Incubez la levure remise en suspension sur glace pendant 20 minutes pour permettre la perméation, puis pelletez les cellules à 400 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et resuspendez les cellules perméables dans 100 microlitres d’eau sans nucléase à l’aide d’une pipette P-1000.

Préparez une solution de travail de tampon de transcription 2,5X avec cinq millimolaires de dithiothréitol fraîchement ajouté et préchauffez un tampon de sondage de structure 2,5X à 30 degrés Celsius. Dans un tube propre de deux millilitres, ajoutez tous les composants de réaction nécessaires et mélangez soigneusement. Ensuite, ajoutez 100 microlitres des cellules de levure préparées dans le tube de réaction et incubez-les dans le thermomélangeur réglé à 30 degrés Celsius, en secouant à 500 tours par minute pendant deux minutes.

Ajoutez ensuite rapidement 200 microlitres du tampon de sondage de structure préchauffé 2,5X, et 25 microlitres de réactif sulfate de diméthyle simultanément. Faites un vortex délicatement sur le tube en deux impulsions et replacez-le dans l’incubateur réglé à 30 degrés Celsius et 500 tours par minute. Continuez l’incubation sur le thermomélangeur pendant quatre minutes, en espacant 30 secondes entre les échantillons.

Préparez à l’avance les tampons d’arrêt et de lavage et placez-les sur la glace jusqu’à utilisation. Arrêtez la méthylation du diméthyle sulfate en ajoutant un millilitre de tampon d’arrêt au tube de réaction. Centrifugez maintenant les échantillons marqués au diméthyle sulfate à 3 500 x g pendant cinq minutes dans une centrifugeuse pré-refroidie.

Après la rotation, jetez le surnageant dans un contenant à déchets approprié. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage refroidi au pellet et remettez en suspension. Répétez la centrifugation à 3 500 x g pendant cinq minutes.

Procédez immédiatement à l’extraction de l’ARN et ne congelez pas la pastille de levure. Résuspendez la pastille de levure marquée au sulfate de diméthelle dans 600 microlitres de tampon de lyse ARN, puis transférez la suspension dans un tube contenant 40 microlitres de dodécylsulfate de sodium à 20 %. Incubez l’échantillon à 65 degrés Celsius pendant 30 secondes, avec un secouement à 950 tours par minute.

Ensuite, effectuer l’extraction du phénol-chloroforme de l’ARN selon la procédure standard. Transformez les billes magnétiques de streptavidine et transférez 44 microlitres des billes dans un nouveau tube pour chaque échantillon de 80 microgrammes d’ARN total. Placez les billes magnétiques sur un support magnétique jusqu’à ce qu’elles se stabilisent.

Après avoir retiré le tampon de stockage, resuspendez les billes dans un millilitre de tampon de pré-lavage A. Maintenant, faites couver la suspension pendant deux minutes à température ambiante, puis aimantez et retirez le surnageant. Après le lavage, resuspendez les billes dans 88 microlitres de tampon de liaison 2X. Transférer 80 microlitres de la suspension dans un tube stérile de 1,5 millilitre contenant 80 microgrammes d’ARN biotinylé dans 80 microlitres.

Faites tourner le mélange d’échantillons de billes sur un rotateur pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, placez le tube sur la grille magnétique pour collecter le flux contenant de l’ARN mature et le conserver pour la précipitation afin d’effectuer la sélection poly-A d’ARN matures en utilisant le flux de travail DMS-MaPseq. Ensuite, rincez deux fois le complexe ARN bille-naissant avec 500 microlitres de tampon à haute teneur en sel.

Puis rince une fois avec 500 microlitres de tampon de liaison 1X, suivi d’un dernier rinçage avec 500 microlitres de tampon faible en sel. Ajoutez maintenant 300 microlitres de réactif ARN au complexe d’ARN naissant, resuspendez-les complètement et incubez sur le thermomélangeur pendant cinq minutes à 60 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 60 microlitres de chloroforme, faites un vortex et faites éclore pendant trois minutes à température ambiante.

Centrifugez l’échantillon à 14 000 x g pendant cinq minutes dans la centrifugeuse pré-refroidie. Enfin, transférez la phase aqueuse supérieure d’environ 180 microlitres dans un nouveau tube de collecte. Éliminez la phase organique restante, laissant derrière elles les billes et la solution aqueuse résiduelle.

Après avoir purifié l’ARN naissant, effectuer la transcription inverse par commutation de modèle, ligature de l’adaptateur 5' et sélectionner les bibliothèques pour le séquençage. La visualisation des produits PCR de test sur un gel à 1 % de agarose a révélé une formation minimale de dimères d’amorce et un frottis caractéristique autour de 300 paires de bases pour le séquençage de suivi co-transcriptionnel ou les bibliothèques CoSTseq et DMS-MaPseq. L’électrophhérogramme pour l’échantillon CoSTseq un a confirmé la distribution de la taille de la bibliothèque avec un pic d’environ 285 paires de bases.

L’alignement des lectures de l’ARNm ASC1 a révélé que la bibliothèque CoSTseq incluait une couverture à travers l’intron, confirmant que l’ARN est naissant. Alors que la bibliothèque DMS-MaPseq ne disposait pas de couverture d’introns, ce qui indique que l’ARN est mature. La matrice de pliage transcriptionnel COT du pré-ARNr 18S a révélé que la réactivité du DMS montrait des changements brusques à mesure que l’ARN polymérase progressait de la position 790 à 811 le long du locus ADNr.

L’analyse de réactivité DMS de l’ARNm ADH1 a montré des profils similaires entre les formes naissantes et matures, indiquant des régions de stabilité structurelle. En revanche, l’ARNm SSA2 présentait des régions de réactivité différente au DMS entre les formes naissantes et matures, suggérant des changements structurels pendant la maturation. Avec CoSTseq, les chercheurs peuvent déterminer in vivo les structures secondaires de l’ARN naissant et la position de l’ARN polymérase le long des transcrits d’ARN.

CoSTseq propose des étapes sensibles au temps, utilise des produits chimiques toxiques. Il est préférable de traiter au maximum deux échantillons à la fois. À partir de l’ARN total généré par CoSTseq, les ARN non biotinylés peuvent être utilisés pour des sondes concurrentes de structures matures en utilisant le DMS-MaPseq traditionnel.