טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי

הליך זה מתחיל בהסרת שאריות מתוך תמיסת נגיף השפעת על ידי צנטריפוגציה. לאחר מכן, קרום הנגיף מפורק באמצעות דטרגנט, ו-VR nps שהשתחררו מופרדים במדרג גליצרין.

שברי סבב (fractions) מהמדרג נאספים, ואליקוט מכל שבר מורץ. על ג'ל SDS-PAGE, הג'לים נצבעים ב-Coomassie Blue כדי לקבוע את השברים השיא המכילים V NPS; השברים המכילים V NPS מרוכזים לאחר מכן על ידי סבב, וה-VRPs המופקים מועברים לרשת דגימה של נחושת עבור TEM, אשר נצבעת לאחר מכן בצביעה שלילית להדמיה של ה-VRPs באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני חולף. שלום, אני WinCo Wu מהמעבדה של ד"ר Nellie Pane במחלקה לזואולוגיה באוניברסיטת קולומביה הבריטית.

אני לינדזי וויבר, בעבר ממעבדת פיין. היום נדגים לכם הליך לניקוי של influenza, קומפלקסים של ריבו-נוקלאו-פרוטאין ויראליים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את הייבוא הגרעיני של נגיף influenza A בתרביות רקמה של תאים.

בואו נתחיל. כדי להתחיל את הניסוי, העבירו 750 µL של MNT buffer לתוך פרועת צנטריפוגה אחת של Beckman מפוליקרבונט בגודל 11 מ"מ על 34 מ"מ. לאחר מכן, הוסיפו לפרועת 500 µL של תמיסה בריכוז 2 mg/mL של influenza A virus; שאיפו והוציאו את הנוזל עם הפפיטה מספר פעמים כדי לערבב את הווירוס עם ה-MNT buffer.

לאחר הערבוב, מקמו את המבחנה ברוטור TLA one 20.2 וסובבו בצנטריפוגת Beckman Optima max E למשך 10 דקות ב-109,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. עם סיום הסבוב, הסירו את העילוי, ולאחר מכן השעיקו את המשקע ב-500 µL של disruption buffer. ערבבו את המשקע המושעה בחוזקה באמצעות וורטקס, ולאחר מכן נערנרו ב-31 °C למשך 20 דקות ב-einor thermo mixer.

עם סיום הנעורה, המשיכו לסבב צנטריפוגה במהירות שיקוע במדרג גליצרול. כדי להכין את מדרג הגליצרול, העבירו את כמויות הגליצרול הבאות למבחנה של צנטריפוגה מסוג Beckman UltraClear בנפח 13 מילימטר על 51 מילימטר: 1 מיליליטר 70% (נפח לנפח) GLYCEROL,‏ 0.75 מיליליטר 50% glycerol,‏ 0.375 מיליליטר 40% glycerol, ו-1.8 מיליליטר 33% glycerol. תמיסות גליצרול אלו הוכנו על ידי ערבוב גליצרול טהור עם NM buffer.

הכינו גם מבחנה מאזנת המכילה הן גליצרול והן תמיסת בופר. לאחר מכן, ערבלו שוב במערבל וורטקס (vortex) את דגימת הנגיף המרוסק והעמיסו אותה על מדרג הגליצרול. הניחו את המבחנה ברוטור מסוג swinging bucket מדגם Beckman MLS 50 וסובבו את המדרג בצנטריפוגה למשך שלוש שעות ו-45 דקות ב-217,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר השלמת הסריפוגציה, אספו ידנית מנות של 250 µL מהמדרג, החל מהחלק העליון של המבחנה. שמרו את הפראקציות על קרח או בטמפרטורה של 4 °C. לאחר איסוף הפראקציות, ניתן לנתח אותן באמצעות SDS poly acrylamide gel electrophoresis.

כדי להתחיל את אנליזת ה-SDS page, העבירו 20 µL מכל פרקציה לשפופרת נקייה. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של באפר לדגימות SDS page בריכוז פי 5, וחממו את הדגימה ל-95 °C למשך חמש דקות. לאחר החימום, centrifugate את הדגימות קצרות והעמיסו אותן על ג'ל Poly acrylamide בריכוז 10% תוך הוספת סממני משקל מולקולרי לאחת הבארים. לאחר מכן, הריצו את הדגימות דרך הג'ל עד שצבע הטעינה brom phenol blue מגיע קרוב לתחתית הג'ל.

הוצא את הג'ל ממכשיר ה-SDS page וצבע את הג'ל ב-kumasi blue. בהתבסס על תוצאות הצביעה, זהה את הפראקציות המכילות בעיקר נקלאו-פרוטאין של שפעת.

חלבון ה-NP של שפעת A הוא בגודל של כ-56 kilodaltons והוא החלבון העיקרי הנמצא בקומפלקסים של ribonucleoprotein ויראליים. לכן, פס ה-NP הוא בדרך כלל הפס החזק ביותר בפרקציות המכילות את ה-VRNPs. בחלק הבא, נרכז את פרקציות ה-VRNP הללו.

שלבו את פראקציות הגליצרול המכילות בעיקר NP, וחלקו אותן לשני מבחנות צנטריפוגה מפוליקרבונט של Beckman במידות 11 מילימטר על 34 מילימטר; מלאו כל מבחנה במים אולטרה-טהורים שעובדו ב-ethyl pyro carbonate או DEPC. לאחר מכן, בצעו פיפטינג מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב. הניחו את המבחנות ברוטור Beckman TLA 120.2 וסובבו בצנטריפוגה במשך ארבע שעות וחצי ב-157,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C.

עם סיום הסבב, הסירו את העילאי ושחזרו את המשקע. חלקו את ה-V NPS המופק למנות של 50 µL של מים שעברו טיפול ב-DEPC; הניחו מנה אחת בצד ואת השאר אחסנו בטמפרטורה של 80- °C. כעת אנו מוכנים להמשיך לצביעה שלילית של ה-VRPs.

דללו מיקרוליטר אחד של VRNP מטוהר לתוך תשעה מיקרוליטרים של באפר PBS שהוכן טרי ועבר סינון כפול; בצעו פריקה חשמלית (glow discharge) לרשת דגימה של נחושת עבור TEM למשך 30 שניות. רשת זו הייתה מצופה בעבר בשכבת Parlow Dion ופילם פחמן. בעזרת פינצטה לאחיזת רשת הדגימה לאחר הפריקה החשמלית, טפטפו טיפה של חמישה מיקרוליטרים של VRNP מדולל על רשת הדגימה.

המתן שמונה דקות כדי לאפשר לטיפה להיספג ברשת. הנח רצועה קטנה של סבב (parfum) במגש, ולאחר מכן טפטף על הסבב שתי טיפות של 10 µL כל אחת של בופר PBS, וכן טיפה של 80 µL של תמיסת צביעה שהוכנה זה עתה, המורכבת מ-1% ammonium mellite. כעת שטוף את רשת הדגימה על ידי הורדתה בזהירות אל תוך שתי טיפות ה-PBS למשך זמן כולל של דקה אחת.

לאחר מכן, השתמש בחתיכת נייר סינון כדי לספוג חלק מתמיסת הדגימה מרשת הדגימה, מבלי לאפשר לרשת להתייבש. מיד לאחר ספיגת טיפת הבאפר האחרונה מרשת הדגימה, טבול את הרשת לחלוטין בתוך טיפת הצבע. המתן דקה אחת.

לאחר דקה אחת, השתמשו בחתיכה חדשה של נייר סינון כדי לספוג לחלוטין את תמיסת הצבע מרשת הדגימה. הניחו לרשת הדגימה להתייבש באוויר במשך מספר דקות לפני התצפית. תחת מיקרוסקופ אלקטרוני חודר, מוצגות כאן תמונות מייצגות של מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת של V nps בצביעה שלילית.

כפי שניתן לראות כאן, ה-V NPS דומים לחלקיקים דמויי מוט בעלי אורך משתנה, שנע בקירוב בין 30 nanometers ל-120 nanometers. ה-NP האוליגומרי מאורגן כשרשרת של מולקולות NP המקופלת הלאה למבנה חוזר של סליל כפול. לכן, ניתן להבחין לעיתים בלולאות בשני קצותיהם של חלקיקים דמויי מוט אלו.

הרגע הצגנו בפניכם כיצד לטהר ולחזות קומפלקסים של ריבנוקלאו-חלבון נגיפי (viral ribonucleoprotein complexes) של שפעת. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לא להשתמש ב-PBS בעת דילול ה-vRNPs אם אתם משתמשים ב-uranyl acetate לצביעה שלילית.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.