שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

פרוטוקול זה משתמש באינטראקציה בין poliovirus לבין nano bodies המזהים Poliovirus כדי להדגים בדיקת לכידה בזיקה פשוטה בשלב נוזלי (liquid phase affinity capture assay) כמותית. באופן עיקרי, נעשה שימוש בחרוזים מגנטיים מצופים בקובלט כדי להשקיע חלבונים מתויגים, כמו גם חלבונים בעלי סימון רדיואקטיבי המקיימים אינטראקציה איתם. ראשית, ערבב את החלבונים המסומנים והמתויגים והדגר בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסיפו חרוזי מגנט הזיהוי של התג, והפרידו את הפראקציה הקשורה של החלבון המסומן מהפראקציה שאינה קשורה באמצעות מגנטים. לאחר מכן, מדדו את האות של החלבון המסומן שנמצא בפראקציה שאינה קשורה וקבעו את כמות החלבון המסומן שנמצאה בה. תוצאות מבדיקת זיקה זו בשלב הנוזלי (liquid phase affinity assay) שימושיות ביותר כאשר נבדקים חלבונים הרגישים לשינוי קונפורמציונלי.

בדיקת לכידה זיקית (affinity capture) בשלב נוזלי זו יכולה לספק תובנה לגבי האינטראקציה בין נאנו-נוגדנים (nanobodies) המזהים את נגיף הפוליו לבין אנטיגנים שונים של נגיף הפוליו. ניתן להחיל שיטה זו גם על אינטראקציות חלבון-חלבון אחרות, בתנאי שניתן לסמן חלבון אחד ולזהות את השני. פיתחנו את השיטה הזו כאשר היינו מעוניינים לחקור את האינטראקציה בין נאנו-נוגדנים המזהים את נגיף הפוליו לבין אנטיגנים שונים של נגיף הפוליו.

מאחר שנגף הפוליו רגיש לשינויים קונפורמציונליים כאשר הוא נקשר למשטח מוצק, השימוש ב-e LSA מוגבל. לכן, יש להעדיף מערכת המבוססת על פאזה נוזלית. דוגמה למערכת כזו המבוססת על פאזה נוזלית ונפוצה במחקר של נגף הפוליו היא המיקרו-פרוטאין.

בדיקת שיקיפה חיסונית (immunoprecipitation). אף על פי שבדיקה זו הוכיחה את ישימותה, היא דורשת את המבנה הגבישי של נוגדן קונבנציונלי, שאינו קיים בננו-גופים (nanobodies). ננו-גופים אלו, שהם נוגדנים בעלי דומיין יחיד מעניינים ויציבים מאוד, ניתנים להנדסה בקלות עם טקסטים שונים.

הוא נמצא בשימוש נרחב. ה-stack מראה זיקה ליוןים דו-ערכיים, כגון ניקל וקובלט, אשר בתורם ניתן לצפות בהם בקלות על חרוזי מגנט. לפיכך, פיתחנו בדיקת לכידה זיקה כמותית פשוטה המבוססת על חרוזי מגנט מצופים בקובלט.

ערבבו את מלאי החרו지를 המגנטיים באמצעות וורטקס והעבירו 10 µL עבור כל דגימה לתוך מבחנה. השקיעו את החרוזים באמצעות מגנט. הסירו את supernatant השקוף כדי לשטוף את החרוזים. הוסיפו 150 µL של binding buffer.

אספו את החרוזיים באמצעות מגנט והסירו את העל-נוזל לאחר שטיפה שנייה. השביו את החרוזיים ב-40 µL של תמיסת קישור (binding buffer) עבור כל דגימה ובקררה. עבור הרקע בדגימה אחת, הכינו באר ללא נגיף מסומן רדיואקטיבית, אך עם נפח שווה של תמיסת קישור עבור הבקרה.

דגמו שתיים של 100% פעילות רדיואקטיבית. הוסיפו את כל הרכיבים לבאר, אך החליפו את הנוגדן הננו-גופי (nano body) בתמיסת קישור (binding buffer). כעת הוסיפו לכל הדגימות 2000 ספירות לדקה (counts per minute) של פוליווירוס גזע 7 סוג 1 המסומן ב-S 35, בנפח כולל של 80 µL של תמיסת קישור.

קבלו את הביקורת. דגימה אחת. הוסיפו 10 µL מדילול של ה-nano body לכל דגימה.

ערבבו היטב במשך 10 שניות על שייקר והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 40 µL של תרחיף חרוזי המגנט השטופים והדגירו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תחת ניעור רציף, השקיעו את החרוזים באמצעות מגנט והעבירו את הנוזל העליון (supernatant) הצלול למבחנה למדידת הרדיואקטיביות של כל דגימה, העבירו 50 µL מהנוזל העליון לבקיר ספירה. הוסיפו 3 mL של תערובת נוזל סינקיליציה ומדדו במכשיר הסינקיליציה.

בצעו שטיפה של החרוזיים המגנטיים המשומשים בתוך מבחנה באמצעות מים, וסובבו בצנטריפוגה ב-500 ×g למשך שתי דקות. השליכו את העליון ותלו את החרוזיים מחדש ב-6 mL של sodium hydroxide בריכוז 0.5 M. לאחר מכן, חלקו את התרחופה למספר מבחנות והדגירו אותן באמבט אולטרסוני למשך חמש דקות.

לאחר שקיעת החרוזיים באמצעות מגנט והסרת הנוזל העליון, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת 2% SDS לכל מבחנה, ולאחר מכן ערבבו באמצעות וורטקס וניעור במשך חמש דקות. כעת, אספו את החרוזיים. הוסיפו מיליליטר אחד של 0.2 molar EDTA ב-pH 7 לכל מבחנה, והדגירו את המבחנות באמבט אולטרסוני במשך חמש דקות.

לאחר מכן אספו את החרוזיים, שטפו את החרוזיים עם 1 ml של מים שלוש פעמים, ולאחר מכן עם 1 ml של תמיסת cobalt chloride בריכוז 10 mM. הניחו את המבחנות על שייקר למשך 10 דקות. המשיכו לאסוף את החרוזיים באמצעות מגנט והשביו אותם לתמיסה (resuspend) ב-1 ml של binding buffer.

שטפו פעמיים ב-1 mL של 20% Ethanol ובסוף השביו את החרוזים לנפחם המקורי של 20% ethanol כדי לקבל חרוזים מחודשים בריכוז של 40 mg/mL. תקנו את רעש הרקע הרדיואקטיבי על ידי הגדרת ביקורות: דגימת ביקורת אחת כערך של 0% רדיואקטיביות ודגימת ביקורת שנייה כערך של 100% רדיואקטיביות.

כעת, עבור כל דגימה, חשבו את אחוז הרדיואקטיביות בסבננט (supernatant) כמדד להשקעה הכללית של הווירוס המסומן רדיואקטיבית על ידי הננו-בדי (nanobody). ניסוי זה מעריך את זיקת ה-PVSS 38 C ונוגדן ספציפי לפוליווירוס תוך שימוש בשלושה אנטיגנים שונים של פוליווירוס: אנטיגן טבעי, אנטיגן מחומם ותתי-יחידות 14 s. באופן מעניין, הרדיואקטיביות בסבננט של הדגימות המכילות תתי-יחידות 14 s המסומנות רדיואקטיבית פוחתת עם עליית הריכוזים של הננו-בדי PVSS 38 C. דבר זה מעיד על עלייה בכמות תתי-היחידות 14 s של הפוליווירוס המחוברות לננו-בדי PVSS 38 C, ובאופן עקיף, לחרו지를 המגנטיים.

מכיוון שלא נצפתה זיקה של pvs S 38 C לצורה האנטיגנית N ולצורה האנטיגנית H של פוליווירוס, נראה כי הננו-בודי (nano body) ספציפי לתת-היחידה 14 s של הפוליווירוס. הזיקה של הננו-בודי לאנטיגנים שלו, כפי שנמדדה בשיטה זו, היא ספציפית בדומה לננו-בודי שאינו קשור. NB one אינו מראה תגובתיות נגד שלוש הצורות האנטיגניות של הפוליווירוס.

מערכת זו מניבה הדירות גבוהה, כפי שמוצג בעקומת תגובה למינון זו שהופקה על ידי חוקרים שונים בימים שונים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע בדיקת לכידה באמצעות זיקה במופע נוזלי אמינה זו בתוך שעתיים, כולל מיחזור החרוזיקים. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של אופן השימוש בבדיקת לכידה בזיקה במופע נוזלי המבוססת על חרוזיקים מגנטיים בעת חקר האינטראקציה בין חלבונים שונים, במיוחד כאשר לא ניתן להשתמש במערכות המבוססות על מופע מוצק.