עיבוד פיין Loblolly PtGen2 cDNA microarray

סרטון זה הופק על ידי חוקרים בבית הספר ליערנות ומשאבי טבע וורנל של אוניברסיטת ג'ורג'יה. מטרתו של סרטון הדרכה זה היא לפרט כיצד לעבד את ה-LOB lolly pine pt, gen two CDNA, microarray שלנו, תוך מתן דגש מיוחד לשטיפה ולטיפול במערך, הן לפני והן אחרי ההיברידיזציה. באופן כללי, הפרוטוקולים שלנו עוקבים אחר אלו שפותחו במכון למחקר גנומי טיגר ובמתקן המשאבים השיתופי למערכים מיקרוסקופיים של ונדרבילט, VMSR, שבו מודפסים המערכים שלנו.

מצאנו כי נדרש עיבוד קפדני יותר של PT Gen two כדי להשיג את רמת העקביות הגבוהה ביותר ביחס לאחידות איכות האות ולרקע נמוך. השלב הראשון הוא שטיפה מקדימה. אנו מבצעים זאת מכיוון שבסניק המנקיטה (spotting buffer) שלנו ישנו תכולת מלח גבוהה מאוד, ושטיפה מקדימה זו נחוצה כדי להסיר מלח זה.

מניחים את הזכוכיות בנשאת זכוכיות למיקרוסקופ וטובלים אותן בעוצמה 15 עד 20 פעמים בתמיסת 0.2%SDS שחוממה מראש ל-43 degrees. לאחר שטיפת הזכוכיות בתמיסת ה-SDS, מוציאים אותן בזהירות בעזרת פינצטה אל תוך צנצנת קופלנד (Copeland jar) המכילה בופר טרום-היברידיזציה. בופר זה מכיל 5XSSC, 0.1%SDS ו-1%BSA, וגם הוא מחומם ל-43 degrees.

מכסים את צנצנת קופלנד (Copeland jar) בפרפיום ומניחים אותה באינקובטור בטמפרטורה של 43 מעלות למשך שעה אחת. לאחר שלב קדם-ההכשרה (pre hybridization), מעבירים את השקופיות לנשאי שקופיות עבור מיקרוסקופ ומעבירים אותן ברצף דרך חמישה החלפות של מים דאיוניים, תוך טבילה של 15 עד 20 פעמים בכל החלפה. לבסוף, מניחים את השקופיות באיזופרופנול וטובלים אותן חמש או שש פעמים לפני סבוב במרכזת Chip 'n Mate לייבוש.

לאחר הצנטריפוגה, מייבשים את השקופיות באמצעות אוויר דחוס העובר דרך מסנן של 0.2 מיקרון. לאחר מכן, מניחים על השקופיות פסי הרמה (lifter slips), שגם הם נוקו באוויר דחוס, ומשתמשים בקצה של פיפטה קטנה כדי לדייק את מיקום פס ההרמה על גבי השקופית.

לאחר מיקום פסי ההרמה (lifter slips), אך לפני הוספת תמיפת ההיברידיזציה, נוסיף 20 µL של 100 mM dihi, three atol לבארי הלחות הממוקמים בקצות התא. כעת אנו מוכנים להוסיף את ה-CDNAs של המטרה, אשר הומסו מחדש בתמיפת היברידיזציה. קצה הפ pipette מונח בקצה פס ההרמה והסלייד, והתמיסה מוספת באיטיות באמצעות פיפטה.

מצאנו כי שימוש באפקט הנימיות להטענת המערכים מספק את העקביות הרבה ביותר ומפחית משמעותית את שילובם של בועות אוויר לא רצויות. לאחר הוספת החומר המטרה למערך, מורכב תא ההכשרה ומכוסה בנייר אלומיניום. לאחר מכן, תא ההכשרה מועמד בבן-מאריא רועד לדגירה למשך הלילה, בדרך כלל 14 עד 16 שעות.

מכשיר אמבט המים מכוון ל-48 °C והשייקר מכוון ל-50 rpm. חשוב לציין כי מרגע הוספת תמיסת ההיברידיזציה ועד לסיום כל שטיפות הפוסט-היברידיזציה, הפעולות מבוצעות בתנאי תאורה עמומים כדי למנוע חמצון פוטו-כימי. למחרת, השקופיות מוצאות מתא ההיברידיזציה ומונחות בצנצנת קופלנד (Copeland jar) המכילה את תמיסת השטיפה מספר 1, שחוממה מראש ל-53 °C.

מניחים לשקופיות להישאר בצנצנת קופלנד (Copeland) למשך כדקה עד שהפסי המרימה נופלים, בנקודה זו מוציאים את השקופיות בעדינות בעזרת פינצטה ומניחים אותן בנשא שקופיות למיקרוסקופ כדי להמשיך בשטיפות. לאחר מכן, טובלים את השקופיות בעוצמה כ-15 עד 20 פעמים במיכל שני, המכיל גם הוא את תמיסת השטיפה מספר 1 בטמפרטורה של 53 מעלות. את המיכל מכסים עם פאראפילם ומניחים אותו במנער אוויר בתוך אינקובטור המוגדר ל-53 מעלות ומאה RPM.

לאחר דגירה של 10 דקות ושטיפה בתמיסת שטיפה מספר 1, טובלים את השקופיות בחוזקה 15 עד 20 פעמים בתוך כלי עם תמיסת שטיפה מספר 2, הנמצאת בטמפרטורת החדר. את הכלי מכסים ב-para film ומניחים אותו שוב על שייקר בטמפרטורת החדר לדגירה של 10 דקות. לבסוף, מוציאים את השקופיות מתמיסת שטיפה מספר 2 וטובלים אותן בחוזקה 15 עד 20 פעמים בתוך כלי עם תמיסת שטיפה מספר 3.

לאחר מכן מעבירים את השקופיות למכל שני של תמיסת שטיפה מספר שלוש, המכוסה בנייר פרפיל, ומניחים אותן שוב על השייקר למשך 10 דקות. לאחר השטיפה הסופית, אנו מרכזים את השקופיות כדי להבטיח ייבוש מלא. לצורך כך, אנו מניחים מכסה של מבחנה Falcon בנפח 15 mil בתוך מבחנה קונית בנפח 50 mil, ומניחים את המערכים בתוך המבחנה הקונית כאשר צד הברקוד פונה כלפי מטה.

לאחר מכן, מסובבים את המבחנות בראש עם דליים נדנדים (swinging bucket head) במהירות של 1500 RPM בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, מעבירים את השקופיות למערכת שנייה של מבחנות קוניות בנפח 50 mil, שעוטפו בנייר אלומיניום. לאחר מכן, מנקים את המבחנות באמצעות גז חנקן, המסונן דרך מסנן של 0.22 micron, וסוגרים אותן לצורך הובלה או אחסון עד לשלב הסריקה.

אנו אוספים נתוני סריקה באמצעות PerkinElmer scan array 5,000. תמונת המערך מחולקת לרשת, ונתוני הסריקה הגולמיים מעובדים ואילו ניתוח הנתונים הראשוני מבוצע באמצעות חבילת תוכנת ההדמיה של bio discovery. לאחר מכן, נתוני עוצמת האות של הנקודות מנורמלים וניתוחים סטטיסטיים מבוצעים באמצעות BRB array tools, חבילה סטטיסטית חזקה וזמינה בחינם עבור מערכי מיקרו-מערכים (microarrays), שניתן להוריד מה-National Cancer Institute.

ניתוחים סטטיסטיים נוספים וחיפושים אחר דפוסי ביטוי גנים בוצעו באמצעות חבילת התוכנה Jeep PPAs לניתוח ודפוסי ביטוי גנים, שהיא חבילת ניתוח מקוונת נוספת הזמינה בחינם. תודה שצפיתם בסרטון שלנו על אופן העיבוד של מערך המיקרו-מערכים PT Gen two של אורן לובלולי (lob lolly pine).

האנשים הבאים היו אחראים על התוכן וההפקה של סרטון הדרכה זה.