החדר דג הזברה המוח Injection

הליך זה מתחיל בקביעת שלב ההתפתחות (staging) של עוברי דגי זברה. כאשר העוברים מגיעים לשלב המבוקש, יש להוציאם מהקוריון. לאחר מכן, יוצרים חורים בצלחת מצופה aros באמצעות קצה של פפית כדי להרכיב את העוברים, ומניחים את העוברים בעדינות בתוך החורים כאשר זנבותיהם פונים כלפי מטה.

לאחר קיבוע העוברים, מזריקים בזהירות צבע פלואורסצנטי לחלל המערכות (ventricle space) של העובר דרך המוח האחורי. לאחר ההזרקה למערכות, העוברים נדגמים באמצעות דימות והנתונים מעובדים באמצעות Photoshop. שלום, אני ג'ניפר גוטמן מהמעבדה של ד"ר הייזל סיב במכון וייטהד למחקר ביו-רפואי ב-MIT בקיימברידג', מסצ'וסטס.

היום נדגים לכם פרוצדורה להזרקה לחדרי המוח של דגי זברה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את התפתחות חדרי המוח ואת המורפוגנזה של האפיתל העצבי בדגי זברה חיים. בשל אופי העוברים השקופים של דגי הזברה, אפיון צורת חדרי המוח עלול להיות קשה.

טכניקה זו היא דרך שימושית ופשוטה להבחין בין החלל המלא בנוזל לבין הרקמה שסביבו, ולאפיין עוברים מוטנטיים שעשויים לסבול מפגמים בהיווצרות חדרי המוח. אז בואו נתחיל. כדי להיערך להזרקה לחדר המוח של דגי הזברה, נתחיל בהכנת מחטי ההזרקה.

למשיכת מחטי הקפילרה משתמשים במכשיר needle polar של חברת Sutter. לאחר מכן, ממלאים את מחט הקפילרה בצבע פלורסצנטי, כגון Texas red dextrin. לבסוף, מרכיבים את המחט המלאה במיקרו-מניפולטור בתוך מערכת להזרקה מיקרוסקופית.

חתוך את המחט באלכסון לגודל המתאים. כדי ליצור קצה משופע, מדוד את גודל הטיפה של המחט ובדוק שהיא נעה בין 1 ל-2 ננוליטר להזרקה בשמן. כדי להתחיל את שלב זה של הפרוצדורה, על פי Kimmel, יש להזריק לכל העוברים 30 דקות לפני השלב המבוקש.

לדוגמה, כדי לחקור את הפרונטריקלים (ventricles) 24 שעות לאחר ההפריה, יש להזריק לעוברים 23 וחצי שעות לאחר ההפריה. את העובר בשלב הרלוונטי מניחים תחת מיקרוסקופ סטריאו, ומסירים בזהירות את הכוריון מהעובר באמצעות פינצטה. לאחר מכן, מכינים את העוברים בצלחת agarose באמצעות צלחת פלסטיק מצופה ב-1% agarose, ומבצעים חורים ב-agarose בעזרת טיפ של פיפט פלסטיק של 200 µL.

הסר בזהירות את פקקי ה-aros מהחורים באמצעות פינצטה. העבר את העובר ואת מצע גידול העובר אל צלחת ה-aros עם החורים. הוסף trica למצע כדי להרדים את העובר ולמנוע תנועה.

במהלך הניסוי, מקמו בעדינות את העובר כאשר הזנב פונה כלפי מטה לתוך החור, וכיוונו אותו כך שמכשיר ההזרקה יימצא בצדו האחורי של העובר. כעת, לאחר שהעובר מוקם ומכוון כראוי בצלחת האגרוס, אנו מוכנים להזרקה לחדרי המוח. ראשית, סדרו את מערך המיקרו-מניפולציה כך שקצה המחט יהיה באותו שדה ראייה של העובר בהגדלה גבוהה.

החדירו בזהירות את המחט דרך לוח הגג הדק של המוח האחורי, ממש מאחורי נקודת הציר R0-R1, מבלי לפגוע ברקמת המוח שמתחתיה, והזריקו כמות צבע מספקת למילוי מלא של הפרוזדורות. ייתכן שיידרשו מספר הזרקות כדי למלא את חלל הפרוזדור, תלוי בשלב ההתפתחותי של העובר. כאשר ההזרקה לעובר הושלמה והוא מוכן לדימות, הכינו צלחת אגר (agarose dish) חדשה עבורו.

באמצעות צלחת נקייה מצופה ב-1%aros, נקב חורים בצלחת והוצא את הפקקים. העבר את העובר לצלחת והוסף trica כדי להרדימו ולמנוע תנועה. הנח את הזנב של העובר שקיבל הזרקה לחדר (ventricle) לתוך החור במיקום המאפשר הדמיה גבית (dorsal image).

העוברי מוכן כעת לדימות. צלם תמונה באמצעות אור תבני (transmitted light). חשוב מאוד לא להזיז את העוברי או את המיקרוסקופ.

בשלב הבא, שנו את ההגדרות במיקרוסקופ וצלמו תמונה באור פלואורסצנטי. מ reposition את העוברי כדי לצלם תמונות מהצד (lateral) הן באור תהום (transmitted light) והן באור פלואורסצנטי. שמרו את כל התמונות כקבצים לצורך עיבוד תמונות ב-Photoshop.

כדי לעבד את התמונות ב-Photoshop, פתחו את תמונות האור המועבר והאור הפלואורסצנטי של אותוו עובר שצולמו באותה מיקום. ודאו שכל ההגדרות זהות. עבור כל תמונה, גררו את התמונה הפלואורסצנטית על גבי תמונת האור המועבר ויישרו אותן בדיוק כאשר התמונה הפלואורסצנטית נבחרת. בחרו בתיקוני תמונה (image adjustments), ולאחר מכן ב-"replace color" ושנו את הרקע השחור ללבן.

בחלון החלפת הצבע (replace color), כווננו את גורם הטשטוש (fuzziness) ימינה עד שהתמונה הפלורסצנטית תיראה אחידה בצבעה. בחלון השכבות, בחרו באפשרות multiply. כדי לצפות בתמונות החפיפה, תמונת חלל הפרוזנטריק (ventricle space) צריכה להתאים בדיוק לתמונת האור המועבר.

שמרו קובץ זה וחזרו על הפעולה עבור תמונות נוספות. אם ההזרקה לחדר (ventricle) בוצעה כראוי, התמונות צריכות להציג קצוות חדים שאינם מפוזרים, כפי שמוצג כאן בתמונות של 25 שעות לאחר ההפריה. בלוח A מוצגת תמונת שדה בהיר (bright field), בלוח B מוצגת התמונה הפלואורסצנטית ובלוח C מוצגת תמונת העל (overlay).

מבט צדי של תמונת השכבה העליונה מוצג בלוח D. מאידך, אם במהלך ההזרקה לחדר המוח המחט מוחדרת עמוק מדי, היא תיכנס לרקמת המוח שמתחת לחלל החדר ותוביל להזרקה שגויה. הדבר גורם לכך שהצבע יהיה נראה מחוץ לחלל החדר ובחלמון, כפי שמוצג כאן. לוח E מציג את תמונת השדה המואר.

פאנל F מציג את התמונה הפלואורסצנטית ופאנל G מציג את התמונה המורכבת (overlaid). מבט צדי של התמונה המורכבת מוצג בפאנל H. החיצים מצביעים על אזורים שבהם הצבע חדר מעבר לחלל הפרוזנקיולות של המוח. בסרטון זה, הדגמנו כיצד להזריק צבע פלואורסצנטי לפרוזנקיולות של מוח דגי zebrafish בהתפתחות.

שיטה זו משמשת להדמיית חלל הפרוזדור של המוח בניגוד לאפיתל העצבי הסובב אותו, והיא שימושית ביותר לקביעת צורת חלל הפרוזדור וכן צורת רקמת המוח הסובבת. טכניקה זו מאפשרת לנו להבין טוב יותר את תהליך היווצרות פרוזדורי המוח ואת המורפוגנזה של המוח לאורך זמן בעובר חי. זהו כלי מצוין לחקר פגמים בהיווצרות פרוזדורי המוח, ולמאפיין ראשוני של מוטנטים במורפוגנזה של המוח.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.