זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

הליך זה מתחיל בגידול של זן הפיתיון במצע המכיל חומצות אמינו רגילות בזן הביקורת של ה-SLAC, ובליזין וארגינין עם איזוטופים כבדים. כמויות שוות של שני הזנים מעורבבות ומולחשות על ידי טחינה וחנקן נוזלי. ליזטים גולמיים, אשר תחילה הועברו למשקע על ידי צנטריפוגה ולאחר מכן נוקו על ידי קישור לחרוזי spheros. לאחר מכן, ליזט התאים נקשר לחרוזי IgG.

החלבונים הקשורים לחרוזי IgG מעוייבים על ידי פרוטאז, מנוסחים ומשוקעים. הדגימה מוכנה כעת לניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסות. שלום, אני ג'סי צ'או מהמעבדה של Lone במחלקה לביולוגיה סביבתית של התא במכון למדעי החיים של אוניברסיטת הבריטיש קולומביה.

היום נדגים לכם פרוצדורה לאנליזה פרוטאומיקה כמותית הנקראת SILAC, בשילוב עם טיהור באמצעות זיקה (affinity purification). אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור קומפלקסים של חלבונים.

נתחיל בתהליך. בפרוצדורה זו, זן הפיתיון (bait strain) מכיל חומצות אמינו רגילות, בעוד שזן הביקורת מסוג SLAC מכיל ליזין וארגינין עם איזוטופים כבדים. כדי להתחיל, גרשו תחילה ליטר אחד של זן הפיתיון וליטר אחד של זן הביקורת בנפרד, עד להגעה לערך המוצג על המסך. לאחר מכן, שפכו את התרבית למבחנות צנטריפוגה של Nalgene בנפח 500 מיליליטר.

יש לאזן את העומס בתאי המשקע ב-2,580 RCF, למזג את המדיום ולסספנד מחדש את המשקע ב-50 milliliters של D H2O קר, תוך העברת התאים למבחנות צנטריפוגה של 50 milliliters. צנטריפוגה את המבחנות כדי לשקיע את התאים ב-3000 RCF. בשלב זה, ניתן להקפיא את המשקע בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

חשוב לזכור להתאים את תרבית זן הביקורת לתרבית זן הפיתיון ביחס של אחד לאחד לפי משקל הכדור היבש. השעה מחדש כל כדור תאים ב-10 milliliters של NP 40 buffer עם תערובת מעכבי פרוטאז ביחס של אחד ל-2000. ערבב את שתי תרביות התאים על ידי העברה ישירה של תוכן מבחנה אחת לשנייה.

כדי להתחיל בגריסת התאים, שפכו תחילה חנקן נוזלי לתוך המכתש שקולל מראש והמתינו עד שיתאדה לחלוטין. לאחר מכן, הוסיפו למכתש שני מיליליטר של תאים. שפכו כמות של חנקן נוזלי כדי להקפיא את התאים.

גרס את התאים עד שהתאים יהפכו לאבקה דקה. חזור על התהליך עד שכל התאים יגרסו. הקפד לא לאפשר לתאים להפשיר.

הוסיפו חנקן נוזלי בעת הצורך. לאחר מכן, העבירו את האבקה לכלי ביקר קר מאוד (בטמפרטורת קרח) והפשירה בטמפרטורת החדר. כאשר השוליים יתחילו להפשיר, הוסיפו 20 milliliters של NP 40 buffer עם PIC בדילול של 1:200 לאחר ההפשרה.

העבירו את הליסאט הגולמי למבחנות Nalgene בנפח 40 מיליליטר וסובבו במהירות של 16,000 RPM ברוטור Sovos SA 600 למשך 30 דקות. בזמן ההמתנה, קחו 300 מיקרוליטר של חרוזי SROs two B ושטפו את החרוזים ב-300 מיקרוליטר של בופר NP 40 שלוש פעמים. לאחר מכן, השביו את החרוזים ב-300 מיקרוליטר בופרים כך שיהיו בתמיסת סלרי (slurry) ביחס של אחד לאחד.

השלב הבא הוא ביצוע ניקוי מקדים (pre-clear) לליזט התאים. לשם כך, העבירו תחילה את הסופרנאט למבחנה חדשה והוסיפו את חרוזי ה-Spheros two B. דגרו על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר למשך 30 דקות.

במהלך הדגירה, קחו 300 µL של חרוזי IgG SROs six ושטפו את החרוזים ב-300 µL של NP 40 buffer שלוש פעמים. לאחר מכן, השעיקו מחדש את החרוזים ב-300 µL buffers כך שיתקבלו תרחיף ביחס של אחד ለአחד. לאחר הדגירה, השקיעו את ה-SROs.

הכנס שני חרוזי מגנט. העבר את הנוזל העליון למבחנה חדשה. זכור לשמור מנה (aliquot) של ליזאט התאים עבור Western blotting מאוחר יותר.

לאחר מכן הוסיפו את חרוזי ה-IgG. חלקו את התוכן לשתי מבחנות כדי להשיג קישור יעיל יותר, והדגירו על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר למשך שעתיים. לאחר הדגירה, אספו את החרוזים בעמודת כרומטוגרפיה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

הקפידו לשמור מנה (aliquot) של הפракציה שאינה קשורה. שטפו את החרוצים עם 10 milliliters של NP 40 buffer.

בשלב הבא, שטפו את החרוזים עם שלושה מיליליטר של בופר TEVC. שוב, זכרו לשמור אליקוט של החרוזים.

דבר זה ישקף את יעילות הקישור לשחרור החרוזים. ראשית, הוסיפו 5 µL של A-C-T-E-V ל-1 mL של בופר TEVC. הוסיפו בופר TEVC לחרוזים ועבדו את התמיסה.

העבירו את התכנים לשתי פחלוני EINOR בנפח 1.5 מיליליטר לצורך ערבוב יעיל יותר, והדגירו על פלטפורמה מסתובבת בחדר קרר למשך לילה. לאחר מכן, סובבו את החרוזיים למטה והעבירו את התסנין לפחלוני 1.5 מיליליטר חדש. שטפו את החרוזיים ב-0.5 מיליליטר נוספים של באפר TEVC לאחר השטיפה.

שילו את שמונת דגימות ה-ELU eight במבחנה אחת. סך הכל צריכים להיות 1.5 milliliters של ELU eight. שמרו אליקוט של ה-TEV Elu eight לצורך שקיעה.

כוון את המנות ל-25% TCA באמצעות TCA בריכוז מאה אחוז. לשם כך, חלק את 1.5 מיליליטר של LU שמונה לשתי מבחנות של 750 מיקרוליטר כל אחת. הוסף 250 מיקרוליטר של 100% TCA למבחנה.

התמיסה צריכה להפוך לעכורה. לאחר מכן, הניחו אותה על קרח למשך 30 דקות, תוך ערבוב תקופתי של התערובת במכשיר vortex לאחר האינקובציה.

סבב במהירות מקסימלית בצנטריפוגת שולחן בחדר קר למשך 30 דקות. שטוף פעם אחת עם 500 microliters של אצטון קר במיוחד המכיל 0.05 normal של חומצה כלורית. לאחר מכן, סבב למשך חמש דקות במהירות מקסימלית בטמפרטורה של four degrees Celsius.

בשלב הבא, שטפו פעם אחת עם 500 µL של אצטון קר מאוד, וסובבו במשך חמש דקות במהירות מקסימלית בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסובבוב, הסירו בזהירות את האצטון ויבשו את המשקע לצורך צביעה בכסף. השעיקו מחדש את המשקע ב-50 µL של SDS sample buffer בריכוז של פי 1.

אם בכוונתכם להשתמש בחלבון שהשקעתם לצורך אנליזה מבוססת ספקטרומטריית מסות, מומלץ לבצע את ההשקעה באמצעות אתנול. לשם כך, הוסיפו תחילה 20 micrograms של גליקוגן, לאחר מכן דללו את הדגימות פי חמישה עם אתנול בריכוז מאה אחוז והביאו את הריכוז ל-50 millimolar של סודיום ביקרבונט באמצעות תמיסת סטוק בריכוז 2.5 molar ב-pH 5.0. ערבבו את התמיסה על ידי היפוך המבחנה.

השאירו את התוכן למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לבסוף, חלקו את התוכן לשתי מבחנות Eppendorf. השקיעו את החלבון שהשקיע באמצעות סרכזים למשך 10 דקות ב-12,000 GS בטמפרטורת החדר.

האליקוויט שנשמר במהלך הליך הטיהור צריך לכלול את ליזאט התאים שעבר ניקוי מקדמי (pre-cleared), את הפראקציה הקשורה, את הפראקציה הבלתי קשורה ואת הפראקציה שנשטפה (eluded). אנו ממליצים לנתח את תכולת החלבונים של האליקוויטים שלעיל באמצעות Western blotting באמצעות נוגדן Anti-TAP או צביעת כסף, כדי לשקף את יעילות הקשירה והשטיפה של הניסוי. בג'ל צביעת כסף זה, נראו SCS two tap מטוהר יחד עם השותפים האינטראקטיביים שלו, והם הושוו לביקורת ללא תג (untagged) ב-Western blot זה.

שברים שונים שנלקחו במהלך טיהור SCS two tap נותחו באמצעות Western blotting באמצעות נוגדן Antit tap. שימו לב כי SCS two tap נדידה במשקל מולקולרי נמוך יותר לאחר אלואוציה על ידי שסוע TEV protease, ולא נותר S SCS two tap על חרוזי ה-IgG לאחר האלואוציה. דבר זה אישש כי הטיהור היה יעיל ביותר.

הרגע הצגנו בפניכם כיצד לטהר קומפלקסים של חלבונים באמצעות טיהור זיקה (affinity purification) עם חרוזי IgG. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא כי זן הבסיס וזן הביקורת תואמים במשקל הפלט היבש (dry pellet weight) לפני תחילת הליך הטיהור. מכיוון ש-LAC מספק לנו מדידות לא מוטיות ומדויקות של השותפים לקשירה של החלבון, אנו מבצעים רק את השלב הראשון של טיהור ה-tap כדי למזער את אובדן הדגימה.

אם אתם חווים כמויות משמעותיות של קישור לא ספציפי, ייתכן שתרצו לבצע את הפרוטוקול המלא, שניתן למצוא במדריך של Cold Spring Harbor. זהו כל הפרוטוקול. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

היי, קדימה, מארק. אה, לך.