פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

המטרה הכוללת של אסטרטגיה ניסויית זו היא לפתור את המכלולים הפונקציונליים המובהקים שחלבון עשוי להיות מעורב בהם באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד כחול, פיצול קומפלקסים של חלבונים מטוהרים ופרופיל מתאם ספקטרומטריית מסה. שיטה זו יכולה לסייע בהוספת מידע ארגוני לרשימות החלבונים שנוצרו על ידי ניסויי ספקטרומטריה מסיביים לטיהור זיקה. היתרונות העיקריים של הליך זה הם שהוא פשוט לביצוע, בעל רזולוציה טובה, והוא דורש מעט יותר עבודה מאשר CMSMS ג'ל קונבנציונאלי.

פרוטוקול זה מותאם לטיהור קומפלקסים של חלבונים מ-200 עד 500 מיליון תאים המבטאים רמות אנדוגניות של חלבון מתויג FLAG. לאחר הפשרת גלולת התא, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוסף חמישה מיליליטר של מאגר ליזה קר כקרח המכיל מעכבי DTT ופרוטאז לתרחיף התא ומערבל לערבוב. דגרו את המתלה על קרח למשך 10 דקות.

העבירו את תרחיף התאים להומוגנייזר קר. לייז את התאים ב -20 עד 30 פעימות, בעזרת העלי ההדוק עד שאין צמיגות מורגשת, ואז העבירו את ההומוגנאט לצינורות מיקרו צנטריפוגה קרים. לאחר צנטריפוגה של הצינורות, העבירו את הליזאט הנקי לצינור קר נקי, והשאירו מאחור כ -50 מיקרוליטר ליזאט.

שמור כמות של 35 מיקרוליטר של ליזאט כדי למדוד את ריכוז החלבון ולפקח על הטיהור. לאחר מכן, הסר את המאגר מהחרוזים שהוכנו בעבר. השעו מחדש את החרוזים עם מיליליטר אחד של הליזאט, ואז ערבבו עם שאר הליזאט.

דגרו את התערובת על גלגל מסתובב בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים. אוספים את החרוזים בצד הצינור בעזרת מגנט. אספו 30 מיקרוליטר של סופרנטנט והשליכו את השאר.

השעו מחדש את החרוזים ב-0.5 מיליליטר של מאגר IPP150 על ידי פיפטינג ארבע עד שש פעמים. לאחר מכן, העבירו את המתלה לצינור קר של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטר של מאגר מקורי של פליטת FLAG.

עם הכביסה האחרונה, העבירו את החרוזים לצינור קר חדש. הסר את המאגר ביסודיות. השעו מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של 200 מיקרוגרם למיליליטר 3X5 פפטיד במאגר פליטה מקורי.

לאחר מכן, דגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בסיבוב עדין. אספו את החרוזים עם המגנט, והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש וקר. חזור על שלב זה פעמיים לפני שתמשוך את כל האלואטים.

רכז את הפליטה עד 25 מיקרוליטר ביחידת פילטר צנטריפוגלית על ידי צנטריפוגה ב-10,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. הכן את הדגימה על ידי הוספת מאגר טעינת דגימה מקורי פי 4 ותוסף דגימה של 0.5% G-250 לפליטה המרוכזת של 25 מיקרוליטר. טען את הדגימה ואת סמני המשקל המולקולרי המקוריים, והשאיר באר ריקה ביניהם.

לאחר מכן, טען 10 עד 20 מיקרוליטר של מאגר טעינת דגימה מקורי פי 1 בכל הבארות הריקות. מלאו את תא הקתודה ב-200 מיליליטר של מאגר קתודה כחול כהה מקורי 1X PAGE בזהירות, כדי לא להפריע לדגימות. מלא את תא האנודה ב-550 מיליליטר של מאגר אנודה מקורי 1X PAGE.

הפעל את הג'ל בחום של 150 וולט למשך 30 דקות. לאחר עצירת הריצה, הסר את מאגר הקתודה הכחול הכהה עם פיפטה סרולוגית והחלף במאגר קתודה כחול בהיר 1X. לאחר המשך הריצה במשך 60 דקות, פתח את קלטת הג'ל והשליך את אחת מצלחות הקלטות.

הג'ל נשאר מחובר לצלחת הקסטה השנייה. מניחים את הג'ל במגש המכיל מספיק תמיסת קיבוע כדי לכסות אותו, ומדגרים למשך 30 דקות בניעור עדין. לאחר מכן, הסר את תמיסת הקיבוע והחלף במים לפני סריקת הג'ל.

כדי להתכונן לספקטרומטריית מסה, הניחו תחילה צלחת תחתונה חרוטית של 96 בארות על גבי צלחת נוספת של 96 בארות כדי לאסוף את הפסולת. חודרים את קרקעית הבארות של צלחת הבאר התחתונה החרוטית 96 בעזרת מחט בגודל 21. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של 50% אצטוניטריל, 0.25% חומצה פורמית לבארות הצלחת המנוקבת.

דגרו את ערימת הצלחות בשייקר למשך 10 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחת ב 500 פעמים G למשך דקה אחת, כך שהנוזל יזרום דרך החורים לצלחת איסוף הפסולת. לאחר חזרה על שלבי הכביסה פעמיים, מלאו את הבארות של צלחת 96 הבאר המחוררת ב -150 מיקרוליטר של אמוניום ביקרבונט 50 מילי-מולרי.

לאחר מכן, הניחו את הג'ל על משטח נקי. פורסים את הנתיב המכיל את הדגימה ל-48 פרוסות זהות. חותכים כל פרוסה לשתיים או שלוש חתיכות קטנות יותר, למעט חמש הפרוסות האחרונות בחלק העליון של הג'ל.

מניחים כל פרוסה ברצף בבאר אחת של הקצה המנוקב שטוף צלחת 96 בארות. מוסיפים 50 מיקרוליטר אצטוניטריל לכל באר ומדגרים את הצלחת בניעור למשך 30 עד 60 דקות. לאחר הסרת הנוזל על ידי צנטריפוגה, הוסף 200 מיקרוליטר של שני מילימטר TSEB ו-50 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט לכל באר.

דגרו את הצלחת בניעור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני הוצאת הנוזל על ידי צנטריפוגה כמו קודם. מייבשים את חתיכות הג'ל על ידי הוספת 200 מיקרוליטר אצטוניטריל טהור ודוגרים בניעור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עד שחתיכות הג'ל לבנות ואטומות. לאחר הסרת האצטוניטריל, הוסף 150 מיקרוליטר טריפסין באמוניום ביקרבונט קר לכל באר.

דגרו את הצלחת עם ניעור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, הניחו צלחת תחתונה חרוטית נקייה מתחת לצלחת המכילה ג'ל, והבטיחו כיוון נכון של הצלחות. לאחר מכן, אספו את הנוזל המכיל את הפפטידים על ידי צנטריפוגה ב-200 פעמים G למשך דקה אחת.

מניחים את הפפטידים המכילים צלחת במאייד צנטריפוגלי ומאדים את הנוזל תוך כדי ביצוע השלב הבא. הוסף לחתיכות הג'ל 150 מיקרוליטר של 50% אצטוניטריל, 0.25% חומצה פורמית. דגירה עם טלטול בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

אוספים את הנוזל לצלחת המיובשת חלקית על ידי צנטריפוגה ב -200 פעמים G למשך דקה. המשיכו לאדות את הפפטידים המכילים צלחת תוך כדי ביצוע השלב הבא. העבירו את תמיסות הפפטיד לצלחת הסינון הצנטריפוגלית השטופה.

הניחו מתחתיה צלחת תחתונה חרוטית נקייה כדי לאסוף את הפפטידים ולצנטריפוגה את ערימת הצלחות כמו קודם. מאדים את הנוזל בצלחת התחתונה החרוטית עד שהבארות יבשות לחלוטין. לאחר הייבוש, ניתן לכסות את הצלחת במכסה סיליקון ולאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לביצוע ספקטרומטריית מסה וניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

תוצאות מייצגות מהאשכול ההיררכי של פרופילי נדידת PAGE מקוריים כחולים של Mta2 וחלבונים מטהרים מוצגות כאן כדנדרוגרמה ומפת חום המייצגת את עוצמות החלבון. פרופיל הנדידה של Mta2 מראה שתי פסגות המעידות על שני קומפלקסים נפרדים. חלק מתתי-היחידות של NuRD מראות דפוס דומה עם השפע הגבוה ביותר במכלול המשקל המולקולרי התחתון.

לעומת זאת, תת-יחידות NuRD אחרות נמצאות בשפע יותר במכלול NuRD בעל המשקל המולקולרי הגבוה יותר. מצד שני, האינטראקטר Mta2, Cdk2ap1, קיים רק במכלול NuRD בעל המשקל המולקולרי הגבוה יותר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים וחצי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את כל הדגימות והריאגנטים על קרח כדי למנוע דיסוציאציה של קומפלקסים חלבונים. ניתן ליישם הליך זה על כל חלבון מעניין, בתנאי שניתן להסתכל עליו ממדיום הזיקה על ידי פליטה תחרותית בתנאים טבעיים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו קו-אימונו-משקעים הפוכים או רציפים כדי לאמת את תת-הקומפלקסים שזוהו.