הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

שלום, שמי בראד המילטון. אני מדען במחלקת המחקר והפיתוח כאן ב-STEM Gen. היום נראה לכם פרוצדורה לתכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים באמצעות גורמי תכנות מחדש המועברים באמצעות לנטי-וירוס.

ניתן להשתמש בפרוצדורה זו הן ליצירת תאי IPS והן לחקר תהליך התכנות מחדש. תאי IPS דומים לתאי ES במורפולוגיה, בסבבי ההתרבויות וביכולת ההבדלה לכל סוגי הרקמות בגוף. לתאי IPS אנושיים יש יתרון מובהק על פני תאי ES, שכן הם מפגינים תכונות מפתח של תאי ES ללא הדילמה האתית הכרוכה בהשמדת עובר כדי להשיג את התאים.

יצירת תאי IPS ספציפיים לחולה עוקפת מכשול משמעותי בטיפולים של רפואה רגנרטיבית מותאמת אישית, על ידי ביטול הפוטנציאל לדחייה חיסונית של תאים מושתלים שאינם אוטולוגיים. בואו נתחיל. במספר נקודות בפרוטוקול זה, תחליפו את המצע של תאי ה-iPSC המתפתחים, או תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים, במצע מותנה.

הכנת מצע זה אורכת שישה ימים. לכן, התחילו לפחות שבוע לפני המועד שבו ברצונכם להתחיל את הניסוי. כדי להתחיל, זרעו בכל באר של שישה.

פלטת בארות עם 2*10⁵ cfu של תאי מאכיל meth בשני מיליליטר (2 mL) של מצע גידול meth. דגירה למשך לילה ב-37°C ו-5% CO₂. למחרת, החלפת המצע למצע תרבית תאי human E-S-I-P-S.

דגרו את המצע למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. אספו את העלייה והחליפו אותה במצע טרי בכל 24 שעות במשך ארבעה ימים. סננו את העלייה דרך מסנן של 0.22 micrometer.

הוסיפו לעלון שנאסף 15 nanograms per milliliter של BFGF (basic fibroblast growth factor). בסוף התהליך תתקבל כמות של כ-16 milliliters של מצע מותנה על ידי Meth; אחסנו את העלון שנאסף מכל יום בנפרד בטמפרטורה של 4 °C. ניתן לשמר מצע מותנה על ידי Meth למשך שבוע עד שבועיים ב-4 °C או למשך מספר חודשים ב-20- °C.

כעת, לאחר שווידאת שהמדיום המותנה במתיל (meth conditioned medium) יהיה מוכן בעת הצורך, נדון בהכנת התאים. המשימה הראשונה ביצירת iPSC היא שימוש בלנטי-וירוסים כדי לבצע טרנסדוקציה לתאי פיברובלסט מעור של אדם, או תאי BJ, עם ארבעה גורמי שעתוק המאפיינים תאי גזע. כדי להכין את התאים לטרנסדוקציה, זרע תאי BJ בצפיפות של 1×10⁵ תאים לבאר בלוח של 6 בארות והעבר לתרבית.

את התאים גדלו בשני מיליליטר של מצע גידול למשך לילה ב-37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide באותו היום. התחל בהכנת פלטות תאי מאכיל (feeder plates) על ידי הוספת שני מיליליטר של 0.1% gelatin מדולל במים לפלטה בעלת שישה בארות (six well plate) ודגירה למשך לילה ב-37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide. ה-gelatin מצפה את הבארות ומשמש כמטריקס עבורם.

כעת תאי ה-BJ מוכנים לטרנסדוקציה לנטיווירלית כדי להכין את הנגיף לטרנסדוקציה. הוסיפו לשני מיליליטר של מצע טרי שש מיקרוגרם למילליטר של polybrene וארבעה לנטיווירוסים, שכל אחד מהם מבטא את אחד מגורמי השעתוק האנושיים: T4, SOX2, Nanog ו-Lin28, כך שכל אחד מהם יהיה באותו ריבוי זיהום, או MOI.

לנטי-וירוסים אלו כלולים כולם בסט הלנטי-וירוסים של גורמי תכנות מחדש אנושיים. כדי לבצע את התעתוק, החליפו פשוט את מצע גידול תאי ה-BJ במצע המכיל את הוירוס. נערו בעדינות את הפלטה כדי שהמצע יכסה את התחתית באופן אחיד.

דגרו למשך לילה ב-37 °C ו-5% carbon dioxide באותו היום. הוציאו מבחנה אחת של תאי מזין cf one meth מחנקן נוזלי והמיסו אותם. הסירו את תמיסת הג'לטין מלוחיות המזין meth, המצופות כעת בג'לטין כל אחת.

נוסיף 0.2 × 10⁵ תאים לשני מיליליטר של מצע גידול meth. נדגור את ה-MES למשך לילה ב-37 °C וב-5% carbon dioxide. למחרת, ננתק את תאי ה-BJ באמצעות 0.05% trypsin EDTA ונבצע צנטריפוגה ב-200 ×g למשך חמש דקות.

לאחר סנטריפוגציה, שאבו את הנוזל העליון ותלו את התאים מחדש במדיום גידול. הסירו את המדיום מלוח התאי המזינים (feeder plate) והוסיפו שתי מיליליטר לכל באר מת suspension של תאי BJ. ריכוז תאי ה-BJ צריך להיות בערך חמישה כפול 10⁴ תאים לבאר.

דגרו למשך לילה ב-37 °C ו-5% carbon dioxide. 24 שעות לאחר הצמדת תאי ה-BJ על פלטת ה-meth feeder, החליפו את המצע למצע תרבית של תאי גזע עובריים או תאי גזע רב-עוצמה מושריים אנושיים (human E-S-I-P-S). המשיכו להחליף את המצע בכל 24 שעות למשך שבעה ימים.

ביום השביעי, החליפו את מצע גידול תאי ה-ES בשני מיליליטר של מצע מותנה ב-meth. תאי המזין (feeder cells) מסוג meth סיפקו את הגורמים המסיסים הדרושים לצמיחת תאי IPS. כעת עלינו להוסיף עוד מאותם גורמים כדי לשמור על בריאות התרבית.

מצע מותנה ב-Meth מכיל את כל הגורמים המסיסים המופרשים על ידי תאי הזנה של Meth שהודגרו למשך לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% carbon dioxide. בעזרת המיקרוסקופ, בחר מושבת תאים. המושבה תזוהה על ידי מראה קטן, דחוס וכישבוני בלוח 24 בארות חדש, אשר הוכן 24 שעות מראש עם תאי הזנה של ccf one meth. העבר את המושבה שנבחרה לתרבית human E-S-I-P-S.

תווך מודגש ב-10 micromolar של מולקולת הגזע Y 2 7 6 3 2. מעכב קינאז תלוי. החליפו את תוך התרבית ללא הוספה של מולקולת הגזע Y 2 7 6 3 2 מדי 24 שעות במהלך שבעת הימים הראשונים.

לאחר שבעה ימים, החליפו את המצע למצע meth. Condition. המשיכו להעביר את התאים (passage) עד אשר יראו מורפולוגיה טיפוסית של תאי ES אנושיים. חפשו מושבות קטנות, דחוסות ודומייות בעלות קצוות חדים.

המושבות צריכות להיות אחידות ובעלות יחס גבוה של גרעין לציטופלזמה. בשלב זה, פיתחת מושבות בעלות מורפולוגיה של תאי ES, אך האם הן מבטאות גם גנים המאפיינים תאי ES? כדי לגלות זאת, צבע את המושבות לסמני פלוריפוטנטיות כגון TRA 180 1 TRA one 60 SSEA four s, SE, a three T four sox, two nanog ו-SSEA one. כדי להתחיל, שטוף בעדינות את התאים שלוש פעמים עם PBS.

בשלב הבא, קבעו את התאים באמצעות 500 µL של 4%paraform, aldehyde או מקבע אחר למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 20 דקות, שטפו את התאים עם PBS 3 פעמים נוספות כדי להסיר שאריות מקבע. לאחר מכן, חסמו קישור לא ספציפי על ידי דגירה של התאים ב-500 µL של תמיסת חסימה (blocking buffer) לכל באר למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שלב החסימה, הוסיפו לכל באר 250 µL של נוגדן ראשוני המדולל ביחס של 1:100 בתמיסת חסימה.

דגרו את התאים עם נוגדן ראשוני למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר נוגדן ראשוני שאינו קשור. דגרו את התאים עם 250 µL של נוגדן משני המדולל ביחס של 1:300 בבופר חסימה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, תוך שמירה הרחק מאור כדי למנוע פוטובליצ'ינג (photobleaching) לאחר הדגירה עם הנוגדן המשני.

שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS עד לשטיפה השלישית. הוסיפו DPI בריכוז של 1 µg/mL כדי לצבוע את הגרעינים. לבסוף, נתחו את ביטוי הגנים של תאי ה-IPS שלכם.

בבדיקת המורפולוגיה תחת המיקרוסקופ של ארבעה תאי פיברובלסטים מעור skin cells אנושיים שעברו טרנסדוקציה משולבת של T four, SOX two, nanog ו-lin 28, נצפו שינויים מורפולוגיים כבר ביום הרביעי לאחר הטרנסדוקציה, וביום ה-17 הפכו צבירי התאים לדחוסים יותר. כדי לאפיין יותר את מושבות תאי ה-IPS המבודדים, בדקנו את נוכחותם של סמני פלוריפוטנציה נפוצים המובעים בתאי ES. המושבות הראו פעילות חזקה של alkaline phosphatase.

בנוסף, בוצעו בדיקות אימונוכימיה או ICC על מושבות תאי ה-IPS עם פאנל של נוגדנים ספציפיים לסמני פלוריפוטנציה, כולל סמני שטח TA 180 1 TRA one 60 SSEA four ו-SS EEA three, וכן סמנים גרעיניים, T four, SOX two ו-Nanog. מושבות ה-IPS שבודדו היו חיוביות לכל הסמנים. תוצאות ה-ICC מראות כי תאי ה-IPS הפגינו את תבנית הביטוי המתאימה של סמני פלוריפוטנציה, מה שמוכיח כי תאי IPS אלו דומים מאוד לתאי ES אנושיים לא מובחלים.

הראינו לכם כעת כיצד להפיק תאי IPS על ידי תכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים באמצעות גנים של תאי גזע. סט לנטיוירוס של גורמי תכנות מחדש אנושיים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לקחת בחשבון מספר גורמים.

ראשית, ייתכן שיהיה צורך לשנות את היחס בין הווירוס הפעיל לתאי המטרה במהלך שלב הטרנסדוקציה הראשוני כדי להשיג יעילות טרנסדוקציה אופטימלית. שנית, תנאי הגדילה של תאי המטרה עשויים להשפיע. תאים בריאים ובעלי יכולת שגשוג (proliferative) הם רגישים יותר לתהליך התכנות מחדש.

שלישית, בעת התאמת הפרוטוקול למספרי תאים שונים, מומלץ להתאים את מספר תאי המטרה באופן יחסי לשטח הפנים של כלי התרבית. לבסוף, יש לשקול שימוש במעכבי ROCK כגון Y 2 7 6 3 2 כדי לסייע בהבטחת תכנות מחדש מוצלח, שכן מחקרים אחרונים הדגימו את יעילותו בשיפור הישרדות של מושבות תאי yes אנושיים. זהו כל הפרוצדורה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.