בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

במאמר וידאו זה, פיברובלסטים אנושיים בוגרים עוברים תכנות מחדש ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות וקטורים רטרוביראליים. ראשית, פיברובלסטים אנושיים עוברים טרנסדוקציה עם וקטורים רטרוביראליים המקודדים את גורמי השעתוק T three four, SOX two, KLF four, ו-cmic.

את הפיברובלסטים המודבקים מגדלים על תאי הזנה עובריים של עכבר למשך 14 עד 28 ימים. את התרביות שנוצרות צובעים עם נוגדן TRA 180 1 כדי לזהות מושבות של תאים שעברו תכנות מחדש. מושבות חיוביות מועברות לאחר מכן לצלחות המכילות MEF לצורך הרחבה.

צביעה אימונו-ציטוכימית מאשרת את הביטוי של סמני פלוריפוטנציות ואת ביסוסן של קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים. לאחר מכן יש לבצע מחקרים נוספים כדי לאפיין את הקווים בצורה מעמיקה יותר. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בתכנות תאים סומטיים ובתרביות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים יתקשו בתהליך, כיוון שזיהוין של מושבות IPSC נכונות הוא מאתגר.

את הפרוצדורה תדגים ד"ר סולה פולאק, עמיתת פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי. התחילו את הפרוצדורה על ידי זריעת תאי Phoenix AM FO בצפיפות של כ-7 עד 8 מיליון תאים לכל צלחת של 10 סנטימטר, ב-10 מיליליטר של DMEM עם גלוקוז גבוה; הניחו באינקובטור וטפחו למשך לילה. למחרת, הכינו תערובות טרנספקציה המורכבות מ-12 מיקרוגרם של וקטור המקודד עבור הגן T34SOX, 2klf, 4cmic או GFP, ו-35 מיקרוליטר של FuGENE 6, בנפח כולל של 500 מיקרוליטר של DMEM עם גלוקוז גבוה ללא סרום ובתוספת L-glutamine.

דגרו את התערובות למשך 20 דקות. לאחר מכן, כדי לבצע טרנספקציה לתאי הפניקס, העבירו בעדינות באמצעות פיפטה את קומפלקסי ה-DNA אל תוך הפלטות המכילות את תאי הפניקס, שצריכות להיות בדרגת התמסכות (confluency) של 70% עד 80%. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C לאחר שש עד שמונה שעות.

שאבו את המצע והחליפו אותו בשמונה מיליליטרים של DMEM עם ריכוז גלוקוז גבוה ואנטיביוטיקה. לאחר מכן, החזירו את הצלחות למדגרה למשך 12 שעות לאחר הדגירה. השתמשו בפיפט כדי לשאוב ולאסוף את המצע המכיל את הווירוס.

לאחר מכן, החליפו את המצע וחזרו על תהליך זה בכל 12 שעות עד שייאסף המצע ארבע פעמים. אחסנו את המצע בטמפרטורה של 4°C. לאחר איסוף כל המצע, שלבו את כל המנות, ואז העבירו אותן דרך מסנן-שפופרת (tube top filter) של 0.45 µm אל תוך שפופרת קונית של 50 mL כדי להסיר תאים שהתנתקו ופסדתיים.

את המצע המסונן, המכיל חלקיקים ויראליים, ניתן לשמור במקרר למשך שבועיים ללא אובדן של הפעילות הזיהומית. הקפאה אינה מומלצת. ביום שלפני הליך הטרנסדוקציה, הפשיר את המלאי הקפוא של פיברובלסטים אנושיים בוגרים והוסף 1×10⁵ תאים לכל באער בלוחות של 6 באערים מצופים בג'לטין.

ביום למחרת, בתוך מבחנה קונית של 50 milliliter, ערבבו 3.5 milliliters של כל אחד מהחומרים T four SOX two, klf four ומצע ויראלי cmic, והוסיפו poly brain לריכוז סופי של six micrograms per liter כביקורת. הכינו one milliliter של מצע ויראלי GFP, three milliliters של מצע תרבית ו-poly brain בריכוז סופי של six micrograms per milliliter. שאבו את המצע מהצלחת המכילה פיברובלסטים אנושיים.

לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטרים של מצע ויראלי מעורב או מצע ביקורת, וסובבו את הפלטות בצנטריפוגה ב-1600 G למשך שעה אחת בטמפרטורה של 20 °C. לאחר הסבב בצנטריפוגה, דגרו את הפלטות למשך כ-12 שעות. לאחר מכן, החליפו את המצע הוויראלי במצע תרבית פיברובלסטים ודגרו למשך 12 שעות נוספות.

חזור על תהליך זה, מהזיהום ועד לתרבית במצע פיברובלסטים, פעמיים נוספות לאחר הזיהום האחרון. גדל את הפיברובלסטים ב-DMEM למשך 48 שעות. לאחר מכן, בדוק את יעילות הזיהום של ההעברות המקבילות באמצעות מצע רטרו-ויראלי של GFP.

בשלב הבא יש להתחיל את התכנות מחדש של תאים סומטיים לתאים פלוריפוטנטיים. הפיברובלסטים שהודבקו יגודלו במצע תאי גזע עובריים אנושיים או במצע HES. זריו פיברובלסטים עובריים של עכבר או MEFs בצפיפות של כ-2*10⁵ תאים לבאר בתוך פלטה בעלת שישה בארות שעברה טיפול בג'לטין, במצע גידול לפיברובלסטים, ביום למחרת.

פצל את הפיברובלסטים האנושיים המודבקים באמצעות 0.05% tripsin EDTA והזרק אותם בצפיפות של כ-1.2 × 10⁴ לתא במצע גידול לפיברובלסטים. למחרת, החלף את המצע במצע HES המכיל 0.5 millimolar sodium butyrate עבור שבעת הימים הראשונים של התכנות מחדש.

יש להחליף את המצע מדי יום. החליפו את המצע במצע HES ללא sodium butyrate והמשיכו בתהליך התכנות מחדש למשך שבעה עד 21 ימים נוספים. החליפו את המצע מדי יום.

בדקו את התאים שעברו טרנסדוקציה לאיתור שינויים מורפולוגיים. מושבות של תאים יתחילו להופיע כ-10 ימים לאחר העברת הפיברובלסטים שעברו טרנסדוקציה על תאי מאכילה (feeder cells). המושבות המכילות את התאים שעברו תכנות מחדש מכונות כעת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים או תאי human IPS.

מושבות תאי ה-IPS האנושיים יהיו מוכנות לבידוד בטווח של 14 עד 28 ימים לאחר זריעתם על תאי ההזנה MEF. בשלב זה, ניתן להעביר את מושבות תאי ה-IPS האנושיים לפלטות המכילות MEF או לפלטות המכוסות ב-matrigel. העברה לפלטות המכילות MEF מודגמת יום לפני איסוף מושבות תאי ה-IPS האנושיים. זרע פלטות 24 בארות המכילות תאי הזנה MEF שהקרינו בגמא בתוך מצע גידול לפיברובלסטים.

דגרו בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2 ביום שבו ייאספו מושבות תאי ה-IPS האנושיים. שאבו את מצע גידול הפיברובלסטים מה-ME Fs ושטפו אותם ב-PBS כדי להסיר שאריות של FBS. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 mL של מצע תאי גזע עובריים אנושיים או מצע HES המכיל 10 µM של מעכב rock Y 2 7 6 3 2 לכל באר. לאחר מכן, בעזרת מיקרוסקופ המותקן במC מתחת למכסה זרימה למינרית, בחנו את פלטות התכנות מחדש לאיתור היווצרות של מושבות תאי IPS אנושיים.

במידת הצורך, הסיר את הפיברובלסטים המקיפים את מושבות תאי ה-IPS האנושיים באמצעות מחט בכילוי 21. שטוף את הפלטות ב-PBS והוסף מצע HES טרי המכיל את הנוגדן הספציפי לתאי חיים TRA 180 1. החזר את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2.

לאחר 30 דקות, החליפו את המצע במצע HES טרי המועשר ב-10 micromolar rock inhibitor. לאחר מכן, בחנו את המושבות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סמנו מושבות חיוביות TRA 1 עד 81.

השתמשו בסימון אובייקטיבי באמצעות מחט במידה 21 gauge. חלקו את מושבות תאי ה-IPS האנושיים החיוביים ל-TRA 180 1 למספר חלקים קטנים. לאחר מכן, בעזרת פיפט אוטומטית, העבירו שברים של מושבות תאי ה-IPS האנושיים לבארות בודדות בלוח של 24 בארות המכיל ME Fs. הימנעו מהעברת תאים שאינם תאי IPS.

הניחו את הצלחות באינקובטור ואפשרו למושבות תאי ה-IPS האנושיים להיצמד למשך 24 עד 36 שעות, והחליפו את המדיום מדי יום. מושבות תאי IPS אנושיים בעלות מורפולוגיה דמוית HE תקינה יהיו גלויות 48 שעות לאחר ההעברה הראשונית לצלחת 24 בארות. בצעו מעבר (passage) ידני של מושבות תאי ה-IPS האנושיים כל שישה עד שמונה ימים על ידי חיתוכן באמצעות מחט בקוטר 21 gauge. הרחיבו את התרביות לצלחת 12 בארות ולאחר מכן לצלחת 6 בארות לאחר הרחבה קלונאלית.

לאחר ביסוס קווי תאי ה-IPS האנושיים, יש לנתח את הביטוי של סמני פלוריפוטנציה TRA-1-60, SSEA-4, T, OCT4, SOX2 ו-nanog באמצעות אימונוכימיה. אפיון מפורט עשוי לכלול ניתוחי דיפרנציאציה in vitro ו-in vivo, ניתוח קריוטיפ, ניתוח השתקת טרנס-ג'נים, מחקרי מתילציה ומחקרי ביטוי גנים.

טרנסדוקציה יעילה באמצעות תוכה המכיל רטרו-וירוס היא קריטית לתכנות מחדש מוצלח כדי לקבוע את יעילות הטרנסדוקציה הוויראלית. פיברובלאסטים בוגרים של בני אדם שהופקו מחולה עם אטקסיה-פרידריך נבדקו לאחר שתי הדבקות רצופות בתוכה רטרו-וויראלית של GFP; כאשר הפיברובלאסטים הודבקו על ידי דגירה פשוטה עם התוכה הוויראלית, פחות מ-20% מהתאים עברו טרנסדוקציה. עם זאת, כאשר הוספת התוכה הרטרו-וויראלית של GFP בוטלה מיד לאחר מכן, יעילות הטרנסדוקציה עלתה באופן דרמטי.

כאן יותר מ-80% מהתאים עברו טרנסדוקציה לצורך ביצוע אפיון ראשוני של מושבות תאי IPS אנושיים מבודדים. ביטוים של סממני פלוריפוטנציה האופייניים לתאי ES אנושיים נבחן באמצעות אימונוכימיה כפי שמוצג כאן. מושבות תאי IPS אנושיים מבודדים היו חיוביות לסממני הפלוריפוטנציה.

T three four SOX two nano SSEA four ו-TRA one 60 DNA. צביעה משולבת (Cos staining) עם DPI המוצגת בפאנלים העליונים מזוהה הן במושבות תאי ה-IPS האנושיים והן בתאי המזינה (feeder cells). תוצאות אלו מוכיחות כי תאי IPS אנושיים שהתקבלו באמצעות פרוטוקול תכנות מחדש זה מבטאים סממני פלוריפוטנטיות מתאימים, המאפיינים תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לא מובחנים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לתכנת מחדש בהצלחה פיברובלסטים אנושיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות טרנסדוקציה רטרו-ויראלית, לזהות מושבות נכונות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים (hiPSCs), ולבצע אפיון ראשוני של hiPSCs.