תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק תאי iPS אנושיים באמצעות ביטוי יתר המתווך על ידי רטרו-וירוסים של OCT4, SOX2, KLF4, ו-MYC, עם מערכת דחליל GFP. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הוספת הכמות המתאימה של רטרו-וירוסים בודדים המבטאים GFP. לאחר מכן, התאים שהודבקו בווירוס המבטא GFP מועברים לפלטות מצופות ג'לטין 0.1% עם פיברובלסטים עובריים של עכבר.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא החלפת המדדיום במדיום לתרבית של תאי גזע עובריים אנושיים. לבסוף, מבודדים מושבות IPS שבהן GFP הושתק ומראות מורפולוגיה דומה לתאי גזע עובריים אנושיים. בסופו של דבר, התוצאות מראות ביטוי של סממנים פלוריפוטנטיים אנדוגניים באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית ו-R-T-Q-P-C-R.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צביעה חיה עם סמן פני שמינוף (pluripotent surface marker) ותצפית על שינוי מורפולוגי, הוא ה-iPad הרצוי. ניתן לבודד בקלות מושבות תאים תוך שימוש באובדן ביטוי של GFP כסמן לתאים פלוריפוטנטיים כדי להתחיל את התרבית. יום אחד לפני ההדבקה, זרע פיברובלסטים אנושיים במצע פיברובלסטים; זרע 1*10⁵ פיברובלסטים אנושיים לתוך באער אחת של פלטת 6 באערים. למחרת, שאב את המצע כדי להסיר תאים מתים והוסף 2 mL של מצע פיברובלסטים טרי עם 5 µg/mL של פרוטמין סולפט.

לאחר מכן, הוסיפו בזהירות את הכמות המתאימה של כל וירוס המבטא GFP, בהתאמה לריבוי זיהום (multiplicity of infection) של חמישה. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה, יום אחד לאחר הזיהום. הסירו את העליון הוויראלי (viral supernatant) ושטפו שלוש פעמים עם 2 mL PBS.

לאחר מכן, הוסיפו 2 mL של מצע גידול לפיברובלסטים שלושה ימים לאחר ההדבקה. בדקו את פלואורסצנציית ה-GFP והשלימו את הבאר ב-2 mL של מצע גידול לפיברובלסטים. למחרת, זרעו 1 × 10⁴ לסמ"ר של פיברובלסטים עובריים של עכבר שהקרינו או תאי מזיני MEF במצע גידול לפיברובלסטים לתוך צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ המצופה ב-0.1% ג'לטין.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה. למחרת, נתקו את הפיברובלסטים האנושיים המזוהמים באמצעות 1 mL של 0.05% trypsin EDTA למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 °C, וסבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-200 G. השעיקו את התאים ב-10 mL של מצע גידול לפיברובלסטים והעבירו את התאים למצעים מצופים מראש ב-0.1% gelatin עם mfs. לאחר 24 שעות.

החליפו את המצע למצע תרבית HESC והחליפו את המצע מדי יום. מושבות דמויות ESC יתחילו להופיע 20 עד 27 ימים לאחר ההדבקה; לאחר הופעת מושבות דמויות ESC, בדקו אותן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה. ודאו היעדר פלואורסצנציית GFP במושבה המראה מורפולוגיה דומה לזו של HSCs.

באמצעות פיפט של 10 microliter, העבירו מושבות בודדות של IPSC והניחו אותן בבאר אחת של פלטת 12 בארות מצופה ב-gelatin וב-meth, בתוספת מצע HESC. החליפו את המצע מדי יום והעבירו את התאים (passage) על ידי שטיפת הפלטה עם one milliliter של DMM F 12.

לאחר מכן, הוסיפו 0.5 milliliter של collagenase והדגירו למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C. שטפו את התאים פעמיים עם DM A MF 12. לאחר מכן, הוסיפו שני milliliters של מדיום HESC טרי.

לאחר מכן, השתמש במגבה תאים (cell lifter) כדי לפרק את המושבות לחלקים קטנים ולהפריד את התאים שנותרו מהפלטה. העבר את חלקי המושבות שהושעו לבאר אחת של פלטה בעלת 6 בארות המצופה בג'לטין וב-MEF, והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך יומיים.

לבדיקת התאים באמצעות אימונופלואורסצנציה, שטוף אותם שלוש פעמים עם PBS וקבע אותם עם 4%paraldehyde למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף בעדינות את התאים שלוש פעמים עם PBS והחדיר חומרים לממברנה (permeabilization) באמצעות 0.2%tritton X 100 ב-PBS למשך 30 דקות.

חסמו קישור לא ספציפי על ידי הדגרה של התאים עם 3%BSA ב-PBS למשך שעתיים. לאחר מכן, הדגירו את התאים עם נוגדן ראשוני למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS והדגירו אותם עם נוגדן שני למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ובחושך.

שטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS במהלך השטיפה האחרונה. הוסיפו dappy והדגירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. דגמו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לצורך מדידה כמותית בזמן אמת.

ביצוע PCR לבידוד RNA כולל מתאי IPC אנושיים שהופקו מפיברובלסטים אנושיים, תוך שימוש בערכה לבידוד RNA. סינתזה של cDNA של הגדיל הראשון באמצעות טרנסקריפטאזה הפוכה.

לאחר מכן, השתמשו בו כתבנית עבור QPCR לגילוי גנים של pluripotency. פיברובלסטים אנושיים, מסוג BJ, שהודבקו בתערובת של רטרו-וירוסים הנושאים את OCT4, SOX2, KLF4 ו-MYC; מוצגים כאן השינויים המורפולוגיים שנצפו במהלך התכנות מחדש מהיום החמישי. בימים 10, 14 ו-21, התאים מתחילים להראות מורפולוגיה דומית לזו של HESC לאחר 21 ימים, וניתן לזהות את ה-iPSCs באמצעות פלואורסצנציית GFP.

תאי גזע פלוריפוטנטיים, כגון ESCs ו-IPCs, מביעים את המכניזם המולקולרי המדכא ביטוי של גנים פרו-ויראליים. עם זאת, הוקטורים הרטרוויראליים המשמשים כאן מביעים GFP יחד עם גני תכנות מחדש באמצעות LTR רטרוויראלי. לכן, תאים המביעים GFP באופן רציף נחשבים כמביעים טרנס-גנים ללא השתקה של גנים פרו-ויראליים; כפי שניתן לראות כאן, מושבות של IPSC שעברו תכנות מחדש באופן נאמן ורכשו את הרשת המולקולרית הפלוריפוטנטית מראות היעדר ביטוי של GFP.

איור זה מציג ניתוח אימונוהיסטוכימי של מושבות שנגזרו מפיברובלסטים מסוג Detroit 5 51 באמצעות נוגדנים ל-TRA 180 1, TRA one 60 SSEA four T four, ו-nano, כפי שניתן לראות בהצלחה. IPCs שתואתקו מחדש מבטאים את כל הסמנים הללו. בנוסף, בוצע RT-PCR כמותי לניתוח ביטוי גנים, אשר גילה כי T four SOX two, KLF four M ו-nano עלו באופן משמעותי בהשוואה לתאי הפיברובלסט ההורים, אך היו תואמים לאלו של H nine HSCs.

לאחר צפייה בסרטון זה, יהיה לכם הבנה טובה של אופן הדבקת הווירוס, וכן של זיהוי ובחירה של תאי IPA שעברו תכנות ליפיד מלא באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.