הימנעות אוסמוטי ב Caenorhabditis elegans: Synaptic פונקציה של שני גנים, Orthologues של האדם NRXN1 ו NLGN1, כמו מועמדים אוטיזם

שלום, שמי מנואל רואיס רוביו מהמחלקה לגנטיקה של אוניברסיטת קורדובה בספרד. אנו משתמשים ב-C. elegans ככלי ניסויי במחקר של אוטיזם, תוך ניצול מערכת העצבים המאופיינת היטב של C. elegans. אנו חוקרים מוטציות של הנמטודה, הפגומות בגנים המעורבים בסינפסה עצבית ואשר קושרו לאוטיזם.

נורקסינים ונוירוליגינים הם מולקולות היצמדות לממברנה הנמצאות בסינפסה. ראשו של Caenorhabditis elegans מכיל את האמפיד, איבר חיש בצמיא של הנמטודה המתווך תגובות לגירויים שונים, כולל חוזק אוסמוטי. האמפיד מורכב מ-12 נוירונים ביפולריים חישיים בעלי דנדריטים ממוצגים ואקסון טרמינלי אחד פרה-סינפטי.

שניים מהנוירונים הללו, המכונים ASHR ו-ASHL, חשובים במיוחד לתפקוד החושי האוסמוטי, המזהה חומרי דחייה מסיסי מים בעלי חוזק אוסמוטי גבוה. אנו מציגים שיטה המבוססת על טבעת פרוקטוז 4M למדידת הימנעות אוסמוטית במוטנטים של C. elegans עם פגם בסינפסות.

כדי להעריך את ההשלכות של neurexin ו-neuroligin בהימנעות מריכוז אוסמוטי גבוה, דיווחנו על התגובה השונה של C. elegans מול מוטנטים הפגומים בגנים nrx-1 ו-nlg-1, תוך שימוש בשיטה המבוססת על תמיסת פרוקטוז בריכוז 4M. ביום הבדיקה, הכין תמיסת מלאי של פרוקטוז בריכוז 4M עם 1% Congo red והמס אותה לחלוטין בטמפרטורת החדר. טבעת בקוטר של סנטימטר אחד על פלטת NGM נמתחת במרכז המצע המוצק.

השתמש ב-15 µL של תמיסת פרוקטוז אדומה בריכוז 4M. הנח לפרוקטוז להיספג באגרגאר למשך כחמש דקות; יש לבצע את הניסוי באופן עיוור. את הצלחת עם כל זן שייבדק יש לסמן על ידי נסיין שני.

את ה-SA מבצעים באמצעות סימנים אלו שאינם מבוקשים. כאשר הניסוי מסתיים, כ-24 שעות לפני ביצוע המכירה, יש לבחור ארבעה זחלים בשלב L4 מכל גנוטיפ ולהעבירם לצלחת AFL NGM המכילה חיידקי e coli ולשמר אותה בטמפרטורה של 20 degrees Celsius למחרת. יש להתחיל את הניסוי עם בוגרים צעירים.

הניחו תולעת בודדת מכל זן בתוך מעגל המנוחה ועקבו אחר כל בעל חיים לצורך תזמון תגובתו למחסום הטיק. יש לבצע את הניסוי עבור 10 בעלי חיים מכל זן ולבצע לפחות שלושה ניסויי שכפול כדי להגיע לתוצאה מכריעה. אלו הנמנעים מהטבעת האדומה שש פעמים ברצף מסווגים כנורמליים.

אלו היוצאים מהטבעת בפחות משש ניסיונות נחשבים כפגומים בבקרת הרגישות האוסמוטית; יש להשתמש במאבטן בקרה SA Bristol בכל ניסוי, ושני בעלי חיים משמשים כביקורות חיוביות מכיוון שהם נמנעים ממחסום הטבעת. מאבטני הבקרה מגיבים על ידי נסיעה לאחור כאשר הם נתקלים במחסום אוסמוטי המורכב מ-4M פרוקטוז. מוטנטים עם חסר נוירונלי מראים התנהגות דומה לכך ביחס לחוזק סוג זה.

עם זאת, מוטנטים חסרי NEUR נכשלו בזיהוי מחסום אוסמוטי זה. חוזקות של מוטנט כפול באללים אקטיביים שונים של neur ו-nout החזירו את הפנוטיפ של סוג הברי, המגיב לעוצמה האוסמוטית. כדי לקבל תולעים מושבתות באמצעות הזנה של RNA interference, מבודדים מושבות של E. coli HD115, זן שעבר טרנספורמציה עם וקטור L4440 המכיל פרגמנט המתאים לגן המטרה. החיידקים מבודדים על צלחת LBA עם אנטיביוטיקה למחרת.

בחרו מושבה של חיידקים והחדירו אותה למצע נוזלי מסוג LV. המשיכו לגדל במשך כשבע שעות עם ניעור ב-37 degrees. טפטפו מטרייה של תרבית זו על פלטת NGM עם carbonic ceiling ו-IPTG והמתינו לילה שלם בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר לחיידקים לגדול ולהתחיל את השראת הביטוי של מקטע הגן המטרה.

יש להשתמש בביקורת חיובית ובביקורת שאינה חיובית עבור הפרעה של RNA. ניסויי האכלה. הביקורת השלילית היא זהה.

HT115 שעברו טרנספורמציה עם וקטור pL4440. הביקורות החיוביות הן תאי HT115 שעברו טרנספורמציה עם וקטור pL4440 המכיל רצף של גן 22. השתקת גן זה גורמת לפנוטיפ של רעידות שניתן להבחין בו בקלות תחת מיקרוסקופ סטריאו.

היום הראשון. ארבעה תולעי L4 משבבי NGM עם חיידקים מועברים לצלחת עם חיידקים ומודגרים ב-20 °C למשך 12 שעות. זוהי תקופה של צום.

ביום למחרת, העבירו את הצעירים הבוגרים במהירות לצלחת שזרעה חיידקים המבטאים את הגן הספציפי המהווה מטרה להשתקת RNA. השאירו למשך כ-48 שעות בטמפרטורה של 20 °C לקבלת צאצאי F1. לאחר מכן, העבירו מספר בוגרי F1 לצלחת אחרת שזרעה את אותם החיידקים במהלך שני הימים הבאים.

בחרו ובדדו בוגרים צעירים מתוך דור ה-F2 של זן הפרא Bristol N2 המודאב בבקטריות. נבצעו מדידות של פנוטיפים; וקטור L44 40 נסוג לאחור כאשר נתקל במחסום האוסמוטי.

זן הטיפוס Bristol and True White שהוזן בחיידקים המבטאים מקטע מהגן nrx-1 של C. elegans לא הצליח לזהות תמיסות פרוקטוז 4M. עם זאת, מוטנט חסר nrx-1, שלא היה מסוגל לזהות את המחסום האוסמוטי, החזיר לעצמו יכולת זו כאשר הוא הוזן בחיידקים המבטאים מקטע מהגן nlg-1 של C. elegans. בסרטון זה, אנו מציגים שיטה פשוטה המאפשרת לחקור את ההשפעה של גנים המשפיעים על תגובת ההימנעות האוסמוטית ב-C. elegans.

טבעת של פרוקטוז בריכוז 4M עם Congo Red משמשת לניתוח תגובת התולעת לריכוז אוסמוטי. מוטנטים חסרי neuroligin פגומים בתגובה זו, עם זאת, מוטנטים של nrx אינם פגומים בזיהוי עקה אוסמוטית ומראים תגובה דומה לזן הטיפוס הפראי. סרטון זה מראה שזני מוטנט כפול הנושאים אללים שונים של knockout בשני הגנים השחזרו את הפנוטיפ של הטיפוס הפראי בתגובה לריכוז אוסמוטי.

תצפיות אלו אומתו באמצעות הפרעה של RNA, בגישת הזנה מבוקרת. בדרך זו, זן הפרא היה פגום בזיהוי מחסום אוסמוטי כאשר הוא הוזן בחיידקים המבטאים את הרצף התואם של הגן ING. מצד שני, מוטנטים פגומים ב-neur, שאינם מסוגלים לזהות תמיסת פרוקטוז בריכוז של 4M, החזירו התנהגות זו כאשר הם הוזנו בחיידקים המבטאים את הרצף התואם של הגן NNU.

התוצאות המוצגות בניסוי זה מעידות כי n seeing ו-neur עשויים להיות מעורבים בחיבור הסינפטי של הנוירונים החושיים של הנמטודה, וכן שהם מקיימים אינטראקציה זה עם זה באופן המשפיע על התפקוד הסינפטי. אוקיי, להתראות ובהצלחה בניסוייכם.