פרדיגמות אפיון תרופתי של C. elegans מוטאנטים הילוכים Synaptic

שלום, אני קודי לוק ממעבדת קולדוול במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת אלבמה. אני קייל לי ואני אראה לכם כיצד להכין תולעים לבדיקות חשיפה ל-outta carb ול-PTZ. אני ברנרד טו ואני אדגים לכם כיצד לבצע בדיקות out carb.

אני קיילין ברי ואני אחראית על סרטוני ה-sea Elegance. במצגת זו, אשמש כקריינית ואדגים את בדיקת החשיפה ל-PTZ. היום, עמיי ועם עמיי נראה כיצד לאפיין מוטציות של תמסורת סינפטית באמצעות מודל אפילפסיה של sea elegance לאחר חשיפה ל-PTZ ו-Alde carb, באמצעות סדרה של זני מוטנטים נבחרים.

אם כן, בואו נתחיל. קייל לי יפתח עבורנו היום את ההדגמה ויציג את הכנת בדיקות ה-ALD carb ביום הראשון של הפרוצדורה. ודאו שלפחות 30 תולעים בשלב בוגר צעיר מכל גנוטיפ ומכל חזרה יהיו זמינות לבדיקות ה-ALD carb ביום השני.

מומלץ שהנסיין יבחר 50 תולעים או יותר בשלב L4 למנות NGM טריות נטולות פטרנקיציד, המזוהרות ב-e coli OP 50 כמקור מזון. יש לגדל את התולעים במשך 12 עד 24 שעות בטמפרטורה עקבית ומאפשרת. טמפרטורה של 20 degrees Celsius עד 22 degrees Celsius היא האידיאלית, אם כי 25 degrees Celsius היא מקובלת.

ביום השני, הכינו תמיסת סטימולציה (stock solution) בריכוז 100 millimolar של Al Decarb ו-70% ethanol, ופזרו את הכמות המתאימה של Al Decarb על מצעי NGM. אנו משתמשים באופן עקבי ב-0.5 millimolar Al Decarb על ידי מריחה של 37.5 microliters של Al Decarb בריכוז 100 millimolar על פטריות Petri לא מאווררות בקוטר 60 millimeter המכילות 7.5 milliliters של NGM. הניחו לצלחות ה-Al Decarb להתייבש למשך כ-30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר.

אין צורך לפתוח את המכסים לאחר שהצלחות יבשו. הוסף נפחים עקביים של e coli למרכז כל צלחת alde carb והייבש למשך 30 עד 60 דקות נוספות. בטמפרטורת החדר, אנו מוסיפים בדרך כלל 25 µl של e coli OP 50.

נפח זה של OP 50 יוצר שטח מזון רחב מספיק כדי להשאיר את התולעים בנקודה קטנה במרכז הצלחת מבלי לגרום לצפיפות יתר. לאחר ששטח המזון התייבש, המשיכו בבדיקות ה-alba carb. בשל אופיה הסובייקטיבי של בדיקות ALD carb, מומלץ מאוד לבצע את הניסויים באופן עיוור.

כדי לבצע זאת, עמית של החוקר הראשי יסמן מחדש את הפלטות המקוריות המכילות את התולעים שייבדקו, או שהעמית יעביר תולעים מהפלטות המקוריות לפלטות cipher alde carb מיד לפני הפעלת הטיימר. כעת, לאחר שהפלטות סומנו, ABO ימשיך בניתוח; כדי להתחיל בניתוח, יש לספור את מספר התולעים המשותקות.

קיימות שתי גישות עיקריות להגדרת שיתוק מושרה על ידי decarb חריף. הגישה הראשונה מגדירה שיתוק על ידי הפסקת השאיבה הלועית. בסרטון זה, ניתן לראות מבנה כהה הממוקם בתוך הלומן של לוע התולעת בצד ימין של המסך.

מבנה זה נקרא ה-grinder והוא מתכווץ באופן קצבי באמצעות מנגנון כולנרגי. תנועת התולעת בסרטון זה הופגרה משמעותית עקב חשיפה ל-Al Decarb. עם זאת, ה-grinder הלועי של תולעת זו עדיין נע בבירור.

לפיכך, תולעת זו אינה משותקת על פי הגדרת הפסקת השאיבה. בסרטון זה ניתן לראות כי הטחנה הבלעומית הממוקמת בצד ימין של המסך אינה מתכווצת, בהתאם להגדרה העובדתית של שיתוק מושרה על ידי al Decarb כהפסקת השאיבה. תולעת זו צריכה להיות מסומנת כמשותקת.

עם זאת, בדומה לתולעת בסרטון הקודם, תולעת זו מראה תנועות חיפוש מזון קלות מצד לצד. למרות שניידותה נפגעה כתוצאה מ-Al Decarb, תנועות אלו ימנעו מהחוקר להגדיר תולעת זו כמשותקת לפי הגישה השנייה להגדרת שיתוק המושרה על ידי Al Decarb, שהיא חוסר ניידות מלא של הגוף וחוסר תגובה למגע. הגישה השנייה להגדרת שיתוק המושרה על ידי Al Decarb כוללת דחיפה עקבית של כל תולעת באמצעות תיל פלטינה ובדיקה של תגובתה.

במידה ותנועות גוף אינן ניתנות לזיהוי בעין בלתי מזוינת, הגישה המועדפת עלינו היא לדחוק את התולעים שלנו פעמיים בראש ופעמיים בזנב בכל 30 דקות, למשך שלוש שעות בסך הכל. כפי שניתן לראות, התולעת בסרטון זה אינה מניעה את גופה באופן ברור. עם זאת, מכיוון שתולעת זו מגיבה לדחוק על ידי הנעת זנבה באופן מובהק, איננו מגדירה תולעת זו כמשותקת.

לפי ההגדרה השנייה של שיתוק המושרה על ידי דה-קרבקסילציה (decarb). בדומה לתולעת בסרטון הקודם, תולעת זו אינה מזיזה את גופה באופן גלוי, ולכן היא דורשת בדיקת דחיפה. עם זאת, בניגוד לתולעת בסרטון הקודם, תולעת זו אינה מגיבה בבירור לדחיפה.

לפיכך, תולעת זו משותקת לפי ההגדרה השנייה של שיתוק המושרה על ידי Al Decarb. למרות שההבדל בין מצב של שיתוק לבין אי-שיתוק על ידי Al Decarb עשוי להיות דק, חוקרים אמורים להיות מסוגלים לזהות שינויים משמעותיים בהעברה סינפטית באמצעות תצפית פשוטה על מספר רב של תולעתים מייצגות שנחשפו ל-Al Decarb מיד לאחר העברתן לצלחות Al Decarb. תולעתים מסוג בר (Wild type) נשארות ניידות.

בסרטון זה, נראה את אותן תולעי הטיפוס הפראי מהסרטון הקודם לאחר שעה אחת של חשיפה ל-Al Decarb. שימו לב כי התולעים מאיטות במידה מסוימת, אך עדיין נעות באופן ברור.

בניגוד לתולעים מסוג בר, מוטנטים של tomasin one בסרטון זה הם או מקובעים לחלוטין או בקושי נעים לאחר שעה אחת של חשיפה. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם העובדה שמוטנטים של tomasin one סובלים מהפרשת יתר של acetylcholine עקב חוסר יכולת לבצע רגולציה שלילית של שחרור מוליכים עצביים בצמתים עצביים-שריריים; עודף ה-acetylcholine במרווחים הסינפטיים בצמתים עצביים-שריריים, בשילוב עם עיכוב של פירוק acetylcholine על ידי Bial Decarb, הופך את מוטנטים של tomasin one לרגישים באופן מוגבר. למרות שלא מוצג כאן, הועלה השערה כי תוצאות דומות נובעות מבדיקות alde carb עם אללים של אובדן תפקוד של on 43, המקודד ל-ortho log של C elegance עבור calcium cal Moulin dependent protein kinase two. סרטון זה מציג מוטנטים של on 25, הסובלים מחסור בתמסורת GABAergic מעכבת.

לאחר שעה של חשיפה ל-alde carb, בדומה למוטנטים tomasin one ו-M 43, מוטנטים אלה מפגינים ליקויים מוטוריים משמעותיים המושרים על ידי alde carb ונראים מושפעים יותר מתולעי wild type שנחשפו ל-al Decarb למשך זמן זהה. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם העובדה כי למוטנטים M 25 ישנם שרירי דופן גוף בעירור-יתר כתוצאה משילוב של חשיפה ל-al Decarb ותמסורת GABAergic מופחתת, מה שמוביל ליחס תמסורת מעורר-מעכב גבוה יותר בחיבורים העצביים-שריריים של ה-CL ELs ושיתוק עוקב. עם זאת, מוטנטים tomasin one on 43 ו-on 25 מראים רגישויות דומות ל-Al Decarb בנקודת זמן זו.

למרות סיבות שונות לגירוי יתר של שרירי דופן הגוף, חוקר לא יוכל לדעת את המנגנון הבסיסי לרגישות-יתר מבלי לדעת תחילה את זהותן של המוטציות הגורמות לכך. עבור סרטון זה, חזרנו לאותם תולעי פרא (wild type) מסרטון קודם לאחר שלוש שעות של חשיפה ל-al Decarb; בנקודה סופית זו של בדיקת ה-ALD carb שלנו, ניתן לראות בבירור שתולעים אלו, למרות היותן מסוג פרא, הן או מקובעות לחלוטין או בקושי נעות. תולעים אלו דומות כעת פנוטיפית למוטנטים TOM one ו-M 25 שהוצגו שעה אחת לאחר החשיפה ל-alde carb, ככל הנראה משום שההעברה הכולנרגית המעוררת הגיעה לרמות דומות; בניגוד לתולעי הפרא, מוטנטים של Synap Bren one נותרים ניידים במידה ניכרת לאחר שלוש שעות של חשיפה ל-alde carb.

תוצאה זו עקבית עם העובדה שמוטנטים של Synaptive Bren one, שחסרים רמות תקינות של הפרשת מוליכים עצביים, חווים פחות גירוי כולנרגי בשרירי דופן הגוף שלהם מאשר תולעי wild type בעקבות חשיפה לרמות זהות של alde carb בנקודת זמן זו. מוטנטים של Point on four, הסובלים מחסור ספציפי בהעברה כולנרגית, אמורים להפגין רגישות דומה ל-Al Decarb כמו מוטנטים של Synaptive Bren one. לעומת זאת, מוטנטים היפר-רגישים של Tomasin one ו-O 25 נותרים משותקים, בדומה לתולעי wild type.

ראוי לציין כי חלק מהתולעים, במיוחד אלו העמידות ל-Al Decarb, עלולות לנסות לזחול אל מחוץ לצלחת. במקרה זה, החוקר רשאי למרוח כמות עקבית של חומצה פלמיטית, המשמשת כמחסום פיזי לתנועת התולעים. סביב צלחות ה-Al Decarb, מרחנו 25 µL של 10 mg חומצה פלמיטית ל-mL אתנול.

בכך מסתיים מודל החשיפה ל-Al Decarb. כעת, אדגים את מודל החשיפה ל-Penta Lean Terazol. קיילין ברי תסייע לנו בביצוע בדיקות ה-PTZ.

ההכנה של התולעים לבדיקות PTZ היא למעשה זהה להכנת התולעים לבדיקות alde carb. ההבדלים המשמעותיים היחידים בין שתי הבדיקות הם הבאים. אנו משתמשים ב-DDH two O כממס ה-PTZ במקום ב-70% ethanol.

בנוסף, מכיוון שאנו פזורים לעיתים קרובות נפחים גדולים יותר של PTZ מאשר של ALDE carb, אנו מאפשרים לצלחות להתייבש למשך שעה אחת לפחות לפני הוספת OP 50. ניתן להשתמש גם בחומצה פלמיטית (Palmitic acid) עם PTZ. כמו כן, חשוב לציין כי PTZ אינו יציב ככל ש-alde carb ויש לאחסנו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.

כדי להתחיל בניתוח, ספרו את מספר התולעים עם התכווצויות אור Those-אפילפטיות כל 30 דקות למשך שעה אחת בסך הכל. מומלץ לדרג את מספר התולעים עם סוגים שונים של התכווצויות בקטגוריות נפרדות, כגון התכווצויות של כל הגוף, התכווצויות קדמיות (שניתן להן השם head bobs), שילוב של התכווצויות קדמיות עם שיתוק שרירי דפנות הגוף (שניתן להן השם tonic-clonic), או שיתוק מלא של הגוף (שניתן להן השם tonic). פעילות דמוית פרכוס, כפי שנראה בתולעת מימין, עוקבת לעיתים קרובות אחר התכווצויות tonic-clonic, כפי שנראה בתולעת משמאל.

פעילות דמוית פרכוסים עשויה לנבוע פשוט מעייפות שרירים בעקבות התכווצויות טוניות-קלוניות חוזרות. עם זאת, נתונים שטרם פורסמו מצביעים על כך שחלק מהתולעים יכולות להפוך לטוניות בעקבות PTZ באופן דומה לשיתוק המושרה על ידי al decarb, מבלי שהיו טוניות-קלוניות בעבר. כאן אנו מראים תולעת מוטנטית מייצגת של העברה סינפטית זוחלת בהיעדרו של PTZ, אנטגוניסט של קולטני GABA ומשרה נפוץ של פרכוסים במודלים שונים של פרכוסים ואפילפסיה בבעלי חיים.

שימו לב כי קצה התולעת או ה"אף" שלה נעים מצד לצד בזמן החיפוש אחר מזון. בסרטון זה, נראה תולעת אחרת מאותו זן מוטנטי של תמסורת סינפטית ששימש בסרטון הקודם. שימו לב כי תולעת זו, שנמצאת בנוכחות של 2.5 milligrams PTZ למיליליטר מים, ממשיכה בעיקר להניע את ראשה מצד לצד בזמן החיפוש אחר מזון.

עם זאת, תולעת זו עוצרת מדי פעם את חיפוש המזון מצד לצד ובמקום זאת דוחפת את קדמתה קדימה באופן חזרתי. לבסוף, יש לצפות בתולעת הנושאת את אותה מוטציה כמו התולעתים בשני הסרטונים הקודמים, בנוכחות של 10 milligrams PTZ ל-milliliter של מים. שימו לב כי בתולעת זו ישנה ירידה בחיפוש המזון מצד לצד, והיא דוחפת את קדמתה קדימה בתדירות ובעוצמה רבות יותר מאשר בריכוז הנמוך יותר של PTZ.

תוצאות אלו מדגימות תלות במינון של PTZ, כפי שאנו 관תה בכל מוטנטים של תמסורת סינפטית הרגישים ל-PTZ. חשוב לציין, כי חשיפה ל-PTZ אינה מספיקה כדי להשרות עוויתות דמויות אפילפסיה בתולעים מסוג בר (wild type). באופן דומה, ניסינו אך לא הבחנו בעוויתות דמויות אפילפסיה המושרות על ידי PTZ בתולעים עם ליקויים ספציפיים בתמסורת כולנרגית, כגון ב-four או בתולעים עם תמסורת כולנרגית מוגברת, כגון ב-tomasin one.

לפיכך, ניתן יהיה לאפיין באופן מעמיק יותר מוטנטים של תמסורת סינפטית בעמידות לאלדהיד קרב (alde carb), ולהבדיל בין ליקויים בתפקוד סינפטי כללי לבין ליקויים ספציפיים בתמסורת כולנרגית, בהתבסס על הרגישויות היחסיות שלהם ל-PTZ. באופן שייתכן ויהיה מפתיע, מוטנט ONC 25 בעל הפחתה חזקה בתפקוד, שבו חסר ביטוי GABA שניתן לגילוי בנוירונים מוטוריים מעכבים ב-C elegance, אינו מראה פרכוסים אפילפטיים ספונטניים כפי שניתן לראות בסרטון זה.

מוטנט ONC 25 ב-10 milligrams PTZ למילילטר של מים. עם זאת, הוא מראה עוויתות טוניות-קלוניות חזקות, למרות שלא מוצג, עוויתות קדמיות בלבד עם תנועה מסוימת הקדימו את העוויתות הטוניות-קלוניות הקשורות ל-ONC 25 ודמו לעוויתות של מוטנטים מסוג synap Bren one. לפיכך, על החוקר לא להניח שכל מוטנטי ה-GABA המעכבים יגלו עוויתות טוניות-קלוניות או פעילות דמוית פרכס טוני קשורה באופן הדוק בנוכחות PTZ, במיוחד בהתחשב בסבירות לקבלת אללים מוטנטיים היפומורפיים.

כעת, לאחר שהדגמנו רגישות-יתר ל-alde carb ול-PTZ אצל מוטנטים של GABA מעכבת, אך רגישות-יתר ל-alde carb בלבד ורגישות רגילה ל-PTZ אצל מוטנטים החסרים ויסות שלילי של תמסורת כולנרגית, עולה השאלה כיצד נראים מוטנטים עם אובדן תפקוד של UNC 43 בתגובה ל-PTZ, שכן גם הם בעלי רגישות-יתר ל-Alda carb בדומה למוטנטים אחרים של תמסורת סינפטית. מוטנטים של 43 אינם מראים פרכוסים אפילפטיים ברורים בהיעדר PTZ, למרות שבמוטנטים אלה מופיעים התכווצויות גוף מלאים ספונטניות, נדירות ולא חוזרות; עם זאת, לאחר חשיפה ל-10 milligrams PTZ למיליליטר מים, מוטנטים עם אובדן תפקוד של 43 מראים פרכוסים חזקים, חוזרים ותלויי-מינון של הגוף כולו. בשלב זה, תוצאות אלו הן מעומעמות, אך נראה שהן מעידות כי ל-on 43 אין תפקיד ספציפי בתמסורת GABAergic מעכבת או תפקיד אך ורק בוויסות שלילי של שחרור מוליכים עצביים.

במערכת העצבים של *C. elegans*, הראינו להדגים כיצד לאפיין מוטנטים של העברה סינפטית ב-*C. elegans* באמצעות ממריצים עצביים משלימים: Aldicarb, מעכב כולנסטראז, ו-PTZ, אנטגוניסט של קולטני GABA. בעת שימוש בפרדיגמה פרמקולוגית משלימה, זכרו כי מידת הרגישות לממריץ עצבי אחד אינה יכולה לנבא את מידת הרגישות לממריץ העצבי השני. שימוש בבדיקות Aldicarb אמור לסייע בהבחנה בין מוטנטים מעכבי GABA, המפגינים תנועת ראש ("head Bob") תחת PTZ אך הם רגישים באופן יתר ל-Aldicarb, לבין מוטנטים עם ליקוי כללי בתפקוד הסינפטי, המפגינים גם הם תנועת ראש תחת PTZ אך עמידים ל-Aldicarb. יתרה מכך, יש להבין כי מוטנטים מעכבי GABA מפגינים תנועת ראש תחת PTZ, בעוד שתולעים חסרות ויסות שלילי של העברה כולנרגית נראות כסוג בר (wild type) תחת PTZ.

לפיכך, ניתן להשתמש גם במבחן ה-PTZ כדי להבדיל בין מחלקות אלו של מוטנטים בתמסורת הסינפטית, ששניהם רגישים יתר על המידה ל-Alde carb. לסיכום, גישה משלימה המשלבת מבחני PTZ ו-Alde carb אמורה לאפשר לחוקר לאפיין מוטנטים של תמסורת סינפטית ב-C elegant באופן שאינו אפשרי באמצעות כל אחת מהתרופות לבדה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.