הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית גינאה חזיר רשתות enteric באמצעות מתח רגיש צבעים
4 בדצמבר 2009
פרוטוקול זה מדגים כיצד מתח רגיש צבעים לאפשר הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית של רשתות עצביות שלמים כגון plexuses של מערכת חזירי הים העצבים enteric, עם רזולוציה מתכווננת אשר נע בין חד תאים למעגל רב ganglionic.
סרטון זה מדגים את הניתוח והדימוג העוקב של דגימות ממערכת העצבים האנטרית שעברו גרייה חשמלית, תוך שימוש בצבע רגיש למתח D-4ANEPPDHQ. מקטע קטן של המעי נלקח מחזיר גינאה שהורדמה והופרד בניתוח כדי לחשוף תחילה את הסובמוקוזה ובסופו של דבר את הפלקסוס המיאנטרי לצורך הקלטות אופטיות. לאחר לכידת תמונה ראשונית ברזולוציה גבוהה, אלקטרודות מונחות על רקמה מקובעת שנצבעה ב-D-4ANEPPDHQ.
שינויים אופטיים המעידים על פעילות חשמלית נרשמים באמצעות מצלמה במהירות גבוהה. במהלך הרכישה במהירות גבוהה, מוחל גירוי חשמלי. התמונה ברזולוציה הגבוהה מונחת לאחר מכן על מפת הפיקסלים של המצלמה במהירות גבוהה לצורך ניתוח באמצעות neuro plex.
שלום, אני בריאן זלצברג, מנהל המעבדה לאופטיקה תאית, או loco כפי שאנו אוהבים לקרוא לה, במחלקה למדעי העצבים באוניברסיטת פנסילבניה. שמי אנליה אובידה, אני גם חברה במעבדה לאופטיקה תאית.
היום נציג בפניכם פרוצדורה להקלטת פעילות חשמלית מרשתות נוירונליות של יונקים בשלמותן באמצעות צבעים רגישים למתח. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור את הקישוריות הנוירונלית בתוך ובין שתי הרשתות המרכיבות את מערכת העצבים האנטרית, המכונה גם "המוח השני" או "מוח המעי". אז בואו נתחיל.
התחילו בהכנת תכשירים של תת-הרירית (sub mucus) והפלקסוס האנטרי (enteric plexus) על ידי כריתת המעי הדק של חזיר ים מסוג Hartley השוקל 150 עד 200 גרם או בן שבועיים עד שלושה שבועות, אשר הורדם באמצעות שאיפת isof fluorine ועבר עריפת ראש. לאחר מכן, הסירו את תכולת המעי על ידי שטיפת הלומן בפתרון M1 99 DM חמים ומחומצן. גזרו מקטע מעי באורך 8 עד 10 סנטימטרים, תוך הקפדה על שימור הפולריות.
העבירו זאת למנתקי זכוכית בני 10 סנטימטרים מצופים ב-sard, המכילים M1 99 DM בטמפרטורת החדר. הניחו את המנתקי על מיקרוסקופ דיסקציה עם תאורת שדה אפל. לאחר מכן, באמצעות מספריים, פתחו את השוליים המזנטריים והשתמשו בסיכות לחרקים כדי לקבע את מקטע המעי כאשר צד הרירית פונה כלפי מעלה.
חשוב מאוד לשמור על מתיחות אחידה כדי שלאחר הקיבוע תהיה לרקמה צורה מלבנית עם שורות של vili ריריים המיושרות באופן סדיר, תוך החזקת פינצטת Dumont עדינה בעלת קצוות ישרים במצב כמעט אופקי. קלפו את הרירית על ידי תפיסת ה-VII בקצה אחד של מקטע המעי ומשיכה לאורך הציר האורכי של הרקמה. המשיכו להפריד רצועות של רירית כדי לחשוף את הסוב-מוקוזה (submucosa) המכילה את הגנגליונים התת-ריריים ואת כלי הדם התת-ריריים.
בשלב הבא, בעזרת מספריים עדינים מאוד, בצעו חתך בשכבת התת-רירית (submucosal layer) בהתאם לכיוון הסיבים השריריים המעגליים. לאחר מכן, הרימו בעדינות רבה את התת-רירית בעזרת פינצטה עדינה, תוך כדי דחיקה של השריר המעגלי כלפי מטה באמצעות המספריים, וחתכו לאורך השוליים האורכיים.
שחרר את הסוב-מוקוזה (submucosa) משאר הדגימה ככל שההפרדה מתקדמת. כעת בצע חתך שני בהתאם לכיוון סיבי השריר המעגליים, במרחק של 1.5 עד שלושה סנטימטרים מהחתך הראשון, כדי לקבוע את הגודל הסופי של דגימת הסוב-מוקוזה; מקטע הסוב-מוקוזה המתקבל הוא בעובי של 30 עד 50 micrometers ונראה דמוי רשת דקה. העבר אותו לכלי syl guard אחר המכיל M1 99 DM טרי, וקבע אותו בעדינות וללא מתיחה באמצעות סיכות.
לאחר מכן, הניחו את הצלחון בתא מחומצן בטמפרטורת החדר לשימוש מאוחר יותר. מקטע המעי המקורי אמור כעת להיות נטול רירית וסב-רירית, והשריר המעגלי אמור להיות חשוף. מקטע זה משמש כעת להפקת תכשיר של הפלקסוס המיאנטרי (myenteric plexus) כדי לחשוף את הפלקסוס המיאנטרי.
הסיר ככל האפשר את שכבת השריר המעגלית באמצעות פינצטה דקה בעלת קצה ישר, על ידי משיכת צרור סיבים מכל צד של הדגימה. לא ניתן להפריד את הפלקסוס המינטרי (myenteric plexus) החשוף משכבת השריר האורכית ומסביב ל-CI שמתחתיה. העבר את דגימת הפלקסוס המינטרי לכלי חדש מצופה ב-sard המכיל M1 99 M מחומצן. לאחר מכן, קבע באופן רפוי את הדגימה המכילה שריר חי באמצעות סיכות. מספר דקות לפני הניסוי האופטי, העבר את הדגימה לכלי קטן יותר מצופה ב-syl guard, המלא כבר ב-M1 99 DM המכיל 2 µM של nefe למניעת התכווצות השריר, וקבע אותה בבטחה על ידי הצבת מספר סיכות דקות מאוד בזהירות מסביב להיקף הכלי.
וודאו שהמתיחה מפוזרת באופן שווה ושהרקמה מונחת בצורה שטוחה לחלוטין על תחתית ה-sil guard. הכנת הרקמה מוכנה כעת לניסויים פיזיולוגיים. הכינו מבחנה מזכוכית המכילה תמיסה עומדת של 5 עד 50 µg/mL של DAI four A-N-E-P-P-D HQ ב-M1 99 M עם 2 µM nifedipine, וכסו אותה בנייר אלומיניום.
אתנול מהתמיסה המרוכזת צריך להוות פחות מ-0.5% מהתמיסה של M1 99 DM עם Nifedipine שכיסתה את הדגימה, ולהחליפה בתמיסת הצבע שהוכנה. באמצעות נפח מספיק של הסולם כדי לכסות לחלוטין את הרקמה, יש להדגיר בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 30 דקות לאחר ההדגירה. שטוף את הדגימה עם M1 99 M מחומצן פלוס NEFE על ידי החלפה של כל תוכן התא.
הקלטה אופטית של פעילות נוירונלית בדגימות שעברו גירוי חשמלי מבוצעת באמצעות מערכת המורכבת ממיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence) זקוף המצויד במפצל תמונה, מצלמה מהירה בעלת דיוק ורזולוציה נמוכה, מצלמה בשחור-לבן בעלת רזולוציה גבוהה, מחולל גירויים הנשלט באמצעות מחשב, ומיקרו-מניפולטור. המכשירים כולם מורכבים על שולחן בידוד רעידות פעיל ומוקפים בווילונות אקוסטים כבדים ובגג מיילר (Mylar) כדי למזער רעידות נישאות באוויר. על אף שניתן לבצע רכישת תמונות משתי המצלמות באמצעות מחשב בודד המריץ את תוכנות neuro plex ו-Global Lab image two או כל תוכנה אחרת לרכישת תמונות, המערך המוצג כאן משתמש בשני מחשבים, כאשר כל אחד מהם שולט במצלמה נפרדת לצורך תחילת הניסויים האופטיים.
הנח את התא המכיל את הדגימה המקומית הצבועה על משטח המיקרוסקופ. מכיוון ש-D four A ו-EPPD HQ הם צבעים שאינם קבועים בממברנה הפלואורסצנציה שלהם מופיעה רק בסביבה ליפידית, נוירונים בריאים מהכנה צבועה של מערכת העיכול צריכים להיראות כבלונים ריקים תחת כל הגדלה הגבוהה מ-20 x בעת הצפייה. השתמש במסננים HQ 5 35 50 לעירור, HQ 5 72 LP four לפליטה ובמראה דיכרואי של 5 65 nanometer.
בשלב הבא, בעזרת בקרים של מיקרו-מניפולטור, מקמיאו מערך אלקטרודות ליניארי רב-חורי בקצה הפה של הרקמה, תוך וידוא שהאלקטרודה אינה נוגעת בעדשת המיקרוסקופ. מערך ליניארי המכיל 10 אלקטרודות טונגסטן המפוזרות על פני טווח של סנטימטר אחד מסוגל לעורר מספר מסלולים עצביים בלתי תלויים, והוא מתאים מאוד לחקר מעגלים גנגליוניים מקושרים. עם זאת, עבור הנתונים המייצגים, השתמשנו באלקטרודת גירוי ביתית בעלת שני מוליכים.
השתמשו בשעווה דביקה (tacky wax) להצבת אלקטרודת הארקה בקצה הנגדי של התא. לפני ביצוע הקלטה פונקציונלית, רכשו תמונה בשחור-לבן ברזולוציה גבוהה של האזור ממנו תוקלט הפעילות החשמלית כדי לסייע בוויזואליזציה. ניתן להפוך את סקאלתי הגוונים כך שהפלואורסצנציה תופיע ככהה. כדי להחיל גירוי זרם באמצעות מחולל הגירויים הנשלט במחשב, תכנתו תחילה את המכשיר על ידי בחירת העוצמה, משך הזמן, התדר ומספר הגירויים המתאימים, וכן את השהיית הזמן ביחס לתחילת רכישת הנתונים האופטיים.
כדי להבטיח שהגירוי יתרחש בתוך גבולות רכישת הנתונים האופטיים, הגדירו את מחולל הגירויים כהתקן הנשלט על ידי neuro plex. לאחר מכן, הגדירו את פרמטרי הרכישה בתוך neuro plex, כולל קצב פריימים, מספר פריימים והגבר מצלמה (camera gain). כדי להשיג רזולוציה מלאה של פוטנציאל פעולה, יש להגדיר את קצב הפריימים למינימום של 1 kHz.
מכיוון ש-D four A ו-E-P-P-G-H-Q מראים ירידה בפלואורסצנציה בעת דפולריזציה, הקשורה באופן ליניארי לשינוי במתח, הפוך את תצוגת האותים האופטיים בתוך neuro plex כך שפוטנציאלי הפעולה לא יופיעו הפוכים. התחל ברכישת הנתונים. זכור לרכוש תמונה חדשה בשחור-לבן ברזולוציה גבוהה של כל שדה ראייה לפני ביצוע כל אחת מההקלטות הפונקציונליות.
עם השלמת הרכישה, השתמשו ב-neuro plex כדי לנתח את התוצאות באופן לא מקוון (offline). אזור במסך הנקרא page display מציג את התמונה הגולמית של הדגימה כפי שנתפסה על ידי המצלמה המהירה ברזולוציה של 80 על 80 כפריים בודד. כאשר מצב הדף הוא absolute frame, מופעלת superimposed של התמונה ברזולוציה הגבוהה שנרכשה עם המצלמה השנייה על גבי מפת הפיקסלים של התמונה הגולמית באמצעות פקודות התצוגה של neuro plex.
שלב זה דורש שינוי של מצב הדף מ-absolute trace ל-traces ובחירה של superimposed image מתוך פקודת התצוגה. השתמש בעכבר כדי לבחור פיקסלים בודדים או קבוצות של פיקסלים מהתמונה המוצגת בתצוגת הדף. הפלטים של אזורי עניין אלה יופיעו כעקומות (traces) בתוך חלון תצוגת העקומות, ויחשפו את עוצמת השינויים האופטיים שנרשמו על ידי אותם פיקסלים כפונקציה של הזמן.
הפיכה של סולם האפורים בתמונה ברזולוציה הגבוהה משפרת את הוויזואליזציה בתצוגת דף מצב העקבה (trace mode), ומומלץ מאוד להציג פלט אנלוגי מהסטימולטור. בחרו את ערוץ הפלט האנלוגי להכללה בתוך חלון תצוגת העקבה. פלט זה מצביע על התזמון המדויק של הגירויים שהוחלו במהלך הניסוי.
כדי לצפות בנתונים כסרטון, השתמש בפקודות הסרטון בתוך neuro plex להצגת פרמים עוקבים בתוך סט נתונים, תוך שימוש בסולמי פסאודו-צבע המותאמים לשינוי המקסימלי והמינימלי בעוצמת הפלואורסצנציה. גנגליון מהכנה של רשת מינטרית שצבעה ב-DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q צולם באמצעות מצלמה ברזולוציה גבוהה ועדשה של 60x. במהלך רכישת הנתונים, ההכנה עוררה באמצעות רצף של חמישה פולסים בתדר של 40 hertz.
כאשר לכל פולס הייתה אמפליטודה של 15 milliamps ומשך של 0.5 milliseconds, זוהו ארבעה אזורי עניין (ROI) והופקו עקבות להצגת הנתונים האופטיים הממוצעים על פני האזורים שנבחרו ברצף פרמי הפסאודו-צבע; אזורי התגובה האופטית הראשונים של דפולריזציית ממברנה המעידה על פעילות נוירונלית מופיעים בצבע צהוב עד אדום. נתונים אלו מעידים כי פעילות שגורמה על ידי גרייה מתרחשת באזורים נפרדים בכל גנגליון, ומועברת בעיקר על ידי אקסוני מעבר. ה-ROIs שני, שלישי ורביעי מזהים נוירונים בודדים במרחקים שונים מ-ROI ראשון.
איור שתיים ממחיש בהגדלה של 10x את המסלולים האנטומיים שדרכם עשוי מידע להתפשט; החיצים מצביעים על הכיוון שבו נע הגירוי כדי להפעיל את הגנגליון המיenteric שזוהה. הראינו לכם כעת את רכיבי ההערכה האופטית להקלטת פעילות חשמלית באמצעות צבעים רגישים למתח, וכיצד יישום טכנולוגיה זו על מערכת העצבים האנטרנית פותח את האפשרות לחקר הקישוריות התפקודית בתוך ובין שתי רשתות יונקיים שלמות תחת השדה של המיקרוסקופ. בעת שימוש בטכנולוגיית הקלטה אופטית, תשומת לב לפרטים היא חשובה ביותר.
יש לשלוט בקפידה במקורות רעש אופטיים, מכניים וחשמליים, ויש לשמור בקפידה על תקינות הדגימה. לפיכך, שליטה בכל אחד מהשלבים הבודדים של פרוטוקול זה היא חיונית להשגת הצלחה בהקלטה אופטית. זהו כל התהליך.
תודה רבה שצפיתם, ובהצלחה רבה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים כיצד צבעים רגישים למתח מאפשרים רישום אופטי של פעילות חשמלית מרשתות עצביות שלמות, כגון הפלקסוסים של מערכת העצבים האנטרית של חזיר ים, עם רזולוציה ניתנת להתאמה הנעה בין תאים בודדים למעגלים מולטי-גנגליוניים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- דימיון אופטי
רקע
- צבעים רגישים למתח חשמלי הם חיוניים לחקר הפעילות העצבית.
- מערכת העצבים האנטרית ממלאת תפקיד משמעותי בתפקוד מערכת העיכול.
- טכניקות של רישום אופטי מספקות תובנות לגבי מעגלים עצביים.
- חזירי ת--> गिनी הם מודלים נפוצים למחקרים אנטריים.
מטרת המחקר
- להדגמה של השימוש בצבעים הרגישים למתח בהקלטות אופטיות.
- לבחינת פעילות חשמלית במערכת העצבים האנטרית.
- לספק פרוטוקול מפורט עבור חוקרים.
שיטות שהשתמשו בהן
- ניתוח של מעי חזיר גינאה לחשיפת הפלקסוס המיינטרי (myenteric plexus).
- צביעת רקמה בצבע הרגיש למתח D-four A-N-E-P-P-D-H-Q.
- דימוי ברזולוציה גבוהה של הרקמה הצבועה.
- הפעלת גירוי חשמלי במהלך הדימוי לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- הקלטות אופטיות מוצלחות של פעילות חשמלית ברשתות עצביות.
- מצלמה מהירה לוכדת שינויים דינמיים בצבע רגיש למתח.
- שילוב של תמונות ברזולוציה גבוהה עם מפות פיקסלים לצורך ניתוח.
- הוכחת יעילות הפרוטוקול לחקר נוירונים אנטריים.
מסקנות
- צבעים רגישים למתח חשמלי יעילים לתיעוד פעילות עצבית.
- שיטה זו יכולה לשפר את ההבנה של תפקודי מערכת העצבים האנטרית.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול למחקרים שונים של רשתות עצביות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
הקלטה אופטית של פעילות חשמלית בהכנות של מערכת העצבים האנטרית באמצעות צבעים רגישים למתח מספקת שיטה לא פולשנית למיפוי קישוריות תפקודית ברשתות עצביות שלמות. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות (target validation) על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה בזמן אמת של תגובות עצביות להפרעות פרמקולוגיות או חשמליות, ובכך היא מפחיתה עמימות מכניסטית בשלבים מוקדמים של הגילוי. יכולת ההסתגלות של הטכניקה למספרי הגדלה שונים מאפשרת לחוקרי ביו-פארמה לעבור מרזולוציה של תא בודד לניתוח מעגלים ברמת הרשת, ובכך לשפר את רמת הביטחון החזויה במעורבות המטרה (target engagement) ובמודולציה של המסלולים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קורלציה בין אירועים מולקולריים להתנהגות חשמלית ברשתות נוירונליות שלמות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות תצפית ישירה על אינטראקציות סינפטיות בתוך ובין גנגליונים.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון במודולציה של המטרה על ידי חשיפת האופן שבו פעילות חשמלית מופצת על פני פלקסוסים מקושרים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות מתוקפפות לסריקות המשך על ידי שימור מרכיבים בודדים של מסלולי רפלקס בהכנות חצי-שלמות.
- פלט כמותי: מייצר שינויים מדידים בפלוורסצנציה הקשורים באופן ליניארי לשינויים במתח, מה שמאפשר זיהוי סטנדרטי של פעילות נוירונלית.
- יכולת הרחבה: מאפשר התאמה של הרזולוציה המרחבית מרמה סוב-תאית (~2.5 μm) לרמות מולטי-גנגליוניות, ובכך תומך בתכנון גמיש של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומר על רלוונטיות משלב הגילוי ועד לשלבים הפרה-קליניים על ידי שימור מערכות האפקטורים של דופן המעי הנשלטות על ידי הפלקסוסים התת-ריריים והמיאנטריים.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהיר תרומות ספציפיות למסלולים השונים בתוצריים פיזיולוגיים, ובכך מפחית את הסיכון בבחירת המטרה.
- הלימה של ביומרקרים: מסייע בזיהוי אותות תלויי-פעילות שעשויים לשמש כביומרקרים תרגומיים לתפקוד הרשת.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת השערות בשלבים מוקדמים של הביולוגיה, תומכת בפיתוח מערכי בדיקה באמצעות קריאות אופטיות הדירות, ומספקת מידע לקבלת החלטות תרגומיות באמצעות מיפוי פעילות ברמת הרשת.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי ויזואליזציה של דפוסי פעילות חשמלית בתגובה לגירוי.
- סריקה: מספק תכשירים מוכנים לבדיקה עם פרוטוקולי צביעה וגירוי סטנדרטיים לזיהוי עקבי של פעילות עצבית.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות זמניות ומרחביות של שינויים אופטיים, המאפשרות השוואה של תנאים בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי שימור השלמות המבנית והתפקודית של מעגלים עצביים אנטריים.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה לשימוש חוזר לחקר דינמיקה של רשתות עצביות במגוון מחלקות מטרה ומודלים של מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בתפקוד רשתות עצביות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של דגירה של צבע, תזמון גירוי וסנכרון תמונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי אספקת ראיות ישירות למעורבות המטרה ברשתות רלוונטיות פיזיולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון על ידי קישור מודולציית מטרה לשינויים מדידים בפעילות החשמלית של הרשת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רקמות, טיפול בצבעים ואלקטרופיזיולוגיה אופטית.
- תלוי במיקרוסקופיית פלואורסצנציה במהירות גבוהה, מחוללי גירויים מנוהרי מחשב ומערכות לבידוד רעידות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי צביעה, פרמטרי גירוי ובחירת אזורי עניין (ROI).
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת הפרוטוקול לסוגי רקמות שונים או לאורגניזמי מודל אחרים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון פוטוטוקסיות של צבע בריכוזים גבוהים והצורך לשמור על חיות הרקמה במהלך דימות ממושך.
