גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

שלום וברוכים הבאים לקבוצת הביולוגיה המבנית והפונקציונלית של ממברנות. שמי מרטין קאפרי (Martin Caffery). מוקד המחקר שלנו הוא הממברנה הביולוגית, שסכימה שלה מוצגת בשקופית הראשונה; הממברנה המקיפה את התא ואת האבגנים התת-תאיים, כאשר הם קיימים, היא מבנה דק מבחינה מולקולרית, העשוי משתי מולקולות ליפיד בלבד ומשובץ בחלבונים.

אנו מעוניינים במבנה ובתפקודים החלים הן על ליפידים והן על חלבונים. עם זאת, לצורך סדרת JO זו, אגביל את המיקוד שלי לחלבוני ממברנה. אנו שואפים להבין כיצד חלבוני ממברנה אלו מתפקדים ברמה המולקולרית משתי סיבות.

ראשית, קיים הסיפוק האינטלקטואלי בידיעה כיצד דבר מה פועל. שנית, כאשר יודעים כיצד הוא פועל, בדומה לאופניים או למכונית, קיימת האפשרות לתקן אותו במקרה של תקלה. תכנון תרופות הוא תוצאה מובנת מאליה של סוג זה של עבודת מחקר.

הגישה שאנו נוקטים כדי להבין כיצד חלבון ממברנה פועל ברמה המולקולרית היא קביעת המבנה הקריסטלוגרפי שלו. הדבר כרוך בקביעת המיקום במרחב תלת-ממדי של כל האטומים, או לפחות של כל האטומים שאינם מימן המרכיבים את החלבון. השיטה שבה אנו משתמשים למטרה זו נקראת קריסטלוגרפיית קרני X של מקרו-מולקולות, או MX בקיצור.

כאן אנו רואים דוגמה לחלבון ממברנה שמבנהו נקבע באמצעות MX; רק חלק קטן מאיכות הגביש של החלבון נדרש כדי לבצע MX. כפי שניתן לדמיין, קיימים שלבים רבים המעורבים בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה של מקרו-מולקולות, כפי שמודגם כאן. בדרך כלל אלו כוללים זיהוי של חלבון ממברנה כמטרה, ולאחר מכן ייצור, טיהור וגידול גבישים שלו.

מדידות עקיפה מבוצעות על הגביש באמצעות מקור קרני X ביתי או סינכרוטרון. נתוני העקיפה מעובדים, ובתוצאה מתקבלת מפת צפיפות אלקטרונים, אשר לאחר מכן מותאם אליה מודל מולקולרי. המודל, לאחר זיקוק (refinement), יכול לשמש לחקר מנגנון הפעולה של החלבון ולתכנון תרופות מבוסס מבנה.

המטרה של מאמר JoVE זה היא להראות לכם כיצד אנו מייצרים גבישים באיכות גבוהה של חלבוני ממברנה באמצעות מזו-פאזות של ליפידים, בשיטה המכונה שיטת ה-in meso. סקירה עדכנית של השיטה והיקפה זמינה במקור מספר 1. הפרוטוקול המפורט שלב אחר שלב שבו נדריך כאן מתואר במקור מספר 2, ותרשים זרימה המסכם את השלבים המעורבים ואת הזמן הנדרש להקמת ניסוי לגבשת חלבוני ממברנה בשיטת in meso מוצג כאן.

סרטון זה מכסה את השלבים המסוגרים בקוים אדומים מקווקווים. הפעולות שעליכם לבצע בקריסטליזציה של meso במצב ידני מוצגות כאן. הן כוללות תמיסה רכזת של חלבון ממברנה מופרק עם ליפידים ליצירת ה-mease המארח, בדרך כלל mono ole כדי להפוך את הליפיד לבולט יותר.

בסרטון זה נעשה שימוש בתמיסות משקיפות של צבע אדום, במכשירים למילוי של צינורות מים מזוקקים ובטיפים חד-פעמיים, ובמגוון מזרקי Hamilton אטומים לגז, חלקם עם מחטים נשלפות, מחבר בעל קוטר צר המשמש לערבוב תמיסת החלבון עם הליפידים ליצירת ה-mease. דספנסר חוזר מבית Hamilton, slides של מיקרוסקופ מזכוכית וכיסויי זכוכית. סרט מרחקים דביק דו-צדדי מנוקב וסילוזי (siloized) ליצירת בארות, פינצטה, קרח גרוס, טישיו, מחשבון והחשוב מכל, מחברת המעבדה שלך.

הנוהל הבא משמש להכנת פלטת התגבשות מסוג "סנדוויץ' זכוכית". לצורך הטעינה, הניחו על השולחן זכוכית מיקרוסקופ מסילוזית. הסירו את כיסוי הנייר המגן מאחד המשטחים של רצועת סרט מרווח דו-דבקי מחורר.

הנח את הסרט כך שהצד הדביק י接גע במשטח השקופית תחת לחץ. הדק את הסרט לשקופית. ניתן להשתמש בבראייר (גלגלת הדפסה) או ברולר; ניתן להניח נייר אלומיניום בין הסרט לרולר כדי להגן על בסיס הבארות.

הסר את כיסוי הנייר השני מהסרט כדי לחשוף את פני השטח הדביקים העליונים שלו. נוהל זה יוצר פלטה של זכוכית שמוכנה לטעינה ולסגירה לאחר השלמת הטעינה. הנח כיסUIImage של סלידים (coverslips) בודדים בקרבת הפלטה לצורך סגירה מהירה ויעילה של הבארים.

הנח את הליפיד בבלוק בבקרה טמפרטורית ב-45 °C למשך שלוש דקות כדי להמיס אותו. שים לב כי הליפיד המשמש בדרך כלל הוא mono land. בסרטון זה, הוסף צבע אדום לליפיד כדי שיהיה ניתן להבחין בו בזמן ההמסה.

הכינו שתי מזרקים של Hamilton בנפח 100 µL עם אטימה לגז לשימוש בשלב ערבוב השומן והחלבון; הסירו את שמן הטפלון מהמזרק שיכיל את תמיסת החלבון. הניחו לצידו את המזרק שיכיל את השומן. במקרה זה, השמן נשאר במקומו.

מקמו את המחבר בעל הקוטר הצר בין שתי המזרקים, ולאחר מכן חברו את המחבר לחיבור המזרק של הליפידים. הדקו את המחבר למזרק, אך הימנעו מהדקה יתרה. הוציאו את הבוכנה מגוף המזרק של הליפידים.

וודאו שהליפיד נמצא במצב נוזלי. כוון את הפיפט ל-30 µL ושבב לאט 30 µL של ליפיד נוזלי מהמכסה. מבחנת הליפיד.

יש לאחסן את הליפיד תחת חנקן או ארגון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. העבר לאט ככל האפשר מהליפיד המומס אל הקצה הפתוח של המזרק, תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות או מרווחי אוויר.

הכנס את הבוכנה לתוך גליל המזרק במגע עם הליפיד המומס והנח את הבוכנה להתקדם באיטיות במעלה הגליל כאשר המזרק מוחזק בצורה אנכית. כפי שמוצג, בועת אוויר שנלכדה בטעות עולה במהלך התהליך ומשתחררת. כעת יש לנו פקק של ליפיד מומס בגליל, שאת נפחו עליך לקבוע באופן מדויק.

ניתן לבצע זאת על ידי קריאת הסימונים על גוף המזרק. במקרה זה, הנפח הוא 23 µL, נתון שנרשם במחברת המעבדה. החלק את הפרווה על המחט הבולטת מהמחבר.

השתמשו בבוכנה כדי לדחוף את הליפיד הנוזלי למעלה בתוך גליל המזרק, ובצורה איטית ועדינה אל תוך המחט שבמרכז המחבר. אם המחט מלאה מעט מדי, ניתן יהיה לראות את הליפיד נובע מהקצה הפתוח שלה. על ידי נסיגה קלה של הבוכנה, ניתן לשאוב חזרה את עודפי הליפיד אל תוך המחבר, עד שיהיה זה בקו אחד עם קצה מחט המחבר.

במקרה זה, יחידת מחבר המזרק טעונה במלואה ומוכנה לחיבור למזרק החלבון. יש לסובב את התמיסה ב-14,000 G למשך 10 דקות, חמש עד 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, כדי להסיר אגרגטים גדולים. לפני הגדרת ניסויי הגבשת, הוציאו את תמיסת החלבון מדלי הקרח והמתינו להשגת שיווי temperatur בטמפרטורת החדר.

חשבו את נפח תמיסת החלבון שיש להשתמש בה כדי ליצור את הפאזה הקובית במילי שואף להידרציה מלאה עבור olean בטמפרטורה של 20 degrees Celsius. הידרציה מלאה במים מתרחשת בערך ב-40% ממשקל המים, כפי שמופיע בדיאגרמת הפאזות. נזכיר כי מילאנו את מזרק הליפידים ב-23 של mono בצפיפות של 0.94 milligrams per microliter.

זה תואם ל-21.6 מיליגרם של ליפיד, ולכן דרושים 21.6 כפול ארבעה חלקי שש, כלומר 14.4 מיליגרם או 14.4 מיקרוליטר של תמיסת חלבון. בעזרת מזרק המילטון של 25 או 50 מיקרוליטר, שאי את הנפח הנדרש של תמיסת החלבון והעבירי את התמיסון לקצה הטפלון של הבוכנה בתוך גליל המזרק. תוך הקפדה על מניעת בועות אוויר, הוציאי בזהירות את המחט ומדדי את נפח תמיסת החלבון במזרק. הנפח צריך להתאים לערך שחושב בשלב הקודם.

כהכנה לשלב עם המזרק הטעון בליפידים, הלהיך בזהירות את תמיסת החלבון במעלה גוף המזרק עד שתהיה גבולה לקצה הפתוח שלו. ניתן לוודא זאת על ידי מבט דרך קצה גוף המזרק.

מטריצת תמיסות החלבון והליפידים במזרקים הטעונים מוכנה כעת לשילוב. כדי לעשות זאת, הברגו את המזרק עם החלבון לקצה הפתוח של המחבר המחובר למזרק עם הליפידים. לאחר שילבתם את שני המזרקים באמצעות המחבר, צריך להיווצר רצף של נוזל מהליפידים במזרק אחד, דרך המחבר, ועד לתמיסת החלבון במזרק השני.

כהכנה לערבוב, היחידה המורכבת מוחזקת כך שמזרק אחד נמצא ביד ימין והשני ביד שמאל. מפעילים מומנט פיתול על שתי חביות המזרקים דרך המחבר, תוך שימוש באצבעות ובבוהן של שתי הידיים כדי להבטיח שהאטם אל מול החריצים במחבר יישאר שלם במהלך ההדקה. בשלב זה, התקן ערבוב מורכב שאינו מהודק כראוי יגרום לנזק ל-ALS ויגרום לדליפה, וגם הדקת יתר תוביל לדליפה.

דבר זה דורש ניסיון הכולל ניסוי וטעייה בלתי נמנעים ואובדן מזדמן של דגימות. לפיכך, כדאי להתאמן עם ליפידים ומים או תמיסת בופר כדי להתרגל למערכת לפני שמתחילים להשתמש בתמיסות חלבון יקרות. כדי לבצע ערבוב, דחפו את הבוחנה בצד החלבון של יחידת הערבוב המורכבת עד לקצה באמצעות האגודל או האצבע, ובכך דחפו את תמיסת החלבון ממזרק החלבון, דרך המחבר ואל תוך מזרק הליפידים. אם היחידה נאטמה ביעילות, פעולה זו תגרום לתנועה שווה והפוכה של הבוחנה בצד הליפידים.

כעת משתמשים בבוכנה בצד הליפידים כדי להחזיר את תכולת מזרק הליפידים דרך המגבב אל תוך מזרק החלבון. תהליך זה חוזר על עצמו פעמים רבות. לעיתים נדרשים מאה מעברים או יותר כדי להפיק פאזת מיסלה הומוגנית.

בתחילת הערבוב, תנועת החומר הלוך וחזור דרך המחבר עשויה להיות לא אחידה, ולעיתים נדרש כוח נוסף כדי להשלימה של פעולת הערבוב. הדבר צפוי. הערבוב הראשוני מלווה בדרך כלל בהיווצרות עכירות לא אחידה בדגימה, וגם זאת ניתן לצפות לה.

ככל שההומוגניזציה מתקדמת, המרקם, כפי שמרגישים דרך הכוח הדרוש להנעת הבוכנות קדימה ואחורה, הופך לאחיד יותר ואופייני לשלב הקובי הצמיגי, וכך גם המראה החזותי של השלב הקובי המתגבש. אם התנאים מתאימים והשלב הקובי נוצר, הדספרסיה צריכה להיראות שקופה מבחינה אופטית בתוך גוף המזרק.

לפיכך, הסימונים על גוף המזרק צריכים להיות קריאים בבירור דרך הפאזה המזו (meso phase) שבגוף המזרק. במקרה של חלבונים צבעוניים, הפאזה המזו תהיה בצבע של החלבון, אך תהיה שקופה מבחינה אופטית. קירור קל מאוד של הדגימה במהלך הערבוב, על ידי הנחת מערבל המזרקים על קרח למשך זמן קצר, עשוי להאיץ את ההומוגניזציה ואת השגת השקיפות.

עם זאת, חשוב שלא להערבב את הדגימה יתר על המידה; יש להקפיד להימנע מערבוב נמרץ במיוחד, שכן הדבר עלול לגרום לעליית טמפרטורת הדגימה עקב חימום חיכוכית. בשלב זה, נוצר שלב ה-cubic mesa והחלבון שולב מחדש לתוך השכבה הליפידית. שלב ה-mesa מוכן כעת לחלוקה לבארות בודדות בלוחיות הגביש.

ראשית, יש להעביר את פאזת המזו למזרק Hamilton של 10 microliter המותקן על דספנסר חוזר (repeating dispenser). התחילו בתהליך זה על ידי חיבור המזרק לדספנסר. טענו את המזרק עם פאזת המזו הקובית.

הסר את המחט ואת הבוכנה מהמזרק. השאר את טבעת הטפלון במקומה. הסר את אום החיזוק מהמתקן בעזרת מטבע קטן.

כאשר זרוע הratchet מושבתת לחלוטין, הכניסו את המזרק ללא הבוכנה והמחט דרך טבעת ההחזקה של הדיספנסר. התקינו מחדש את אטם הקשר המקבע כאשר הצד של האטם פונה אל המזרק, והבריגו אותו בחוזקה לקצה הפתוח של המזרק.

יש להקפיד לוודא שהמזרק ממוקם במרכז טבעת התמיכה ושהגליל מיושר במקביל לזרוע גלגל השיניים. ניתן להעריך את שני הדברים הללו על ידי I. שני דרישות אלו חשובות, שכן אם הבוכנה לא תזוז בחופשיות, יצטבר לחץ במזרק המקור במהלך הטעינה ועלול להתרחש דליפה. העבירו את הבוכנה דרך טבעת האחיזה עם אום האחיזה, כאשר הוא מסובב החוצה מספר סיבובים, והנחיתו את הבוכנה אל הקצה הפתוח של המזרק.

לחצו על זרוע השליפה (ratchet arm) עד הסוף כדי להחדיר את הבוכנה לתוך הגליל, ובדקו שהיא נעה בחופשיות ובמלואה בתוך הגליל. אם הבורג ומוט המוליך היו משוחררים, הדקו אותם שוב ובדקו שוב שהבוכנה נעה בחופשיות. כעת מזרק הדיספנסינג מוכן לטעינה.

הזז את הבוכנה בצד אחד של יחידת הערבוב המורכבת לסימון ה-0 µL. כדי להעביר את הפאזה המזוזופאזית למזרק השני ולמחבר, נתק את המזרק הריק עם ה-UL שלו במקומו מיחידת הערבוב, וחבר מיד את המזרק הטעון עם המחבר המחובר לקצה המוברג של מזרק החלוקה בנפח 10 µL.

מידת ההידוק של החיבור היא קריטית. כפי שצוין כבר, טענו את מזרק החלוקה על ידי לחיצה על בוכנת המזרק בנפח 100 µL, כך שהפאזה המזו תועבר דרך המחבר. אם החיבור הדוק והבוכנה במזרק החלוקה נעה בחופשיות, אזי הבוכנה אמורה להתחיל לנוע בכיוון התנועה של בוכנת הטעינה ככל שמזרק החלוקה מתמלא.

נתק את מזרק הטעינה עם המחבר המחובר ממזרק הפילוג. חבר מחט קצרה בעלת קצה שטוח לסיום הפלדה של מזרק הפילוג והדק אותה בזהירות במקומה. קבע את הבוכנה לזרוע השבץ על ידי הידוק הקשר בטבעת האחיזה.

יש להיזהר לא להדק את הקשר יתר על המידה, שכן הדבר עלול לשרוט ולעוות את הבוכנה ולהפוך אותה לבלתי שמישה. חשוב שטווח התנועה המוקצה לזרוע הראצ'ט במצב clamped יוגבל למרחק של אינץ' אחד לכל היותר.

כפי שמוצג בהמשך, לבוכנה תהיה נטייה להתעקם וההזרקה עלולה להיכשל. לחץ על תוף הגלגלת מספר פעמים כדי להניע את הבוכנה בתוך גוף המזרק, ובכך למלא את הנפח הריק של המחט ולהטעין אותה. יש לחזור על שלב זה עד 10 פעמים, עד שחוט רציף של פאזת המסה (mesa phase) יצא מקצה המחט.

המחט מוכנה כעת לשימוש בהקמה של ניסויי התגבשות, אשר צריכים להתחיל באופן מיידי. לא מומלץ להשאיר את הפאזה הקובית הטעונה בחלבון למשך זמן רב מדי לפני הקמת ניסויי ההתגבשות. מכיוון שחלבונים מסוימים אינם יציבים בפאזה הקובית ללא תוספת של משקיף, הניחו פלטת התגבשות בעלת מספר בארות וכיסוי זכוכית (cover slip) על משטח המוגבה מספר אינצ'ים מעל השולחן כדי להקל על הטעינה.

ניגודיות אופטימלית ונראות משופרת מושגות כאשר הפני השטח כהים מעט. הומוגניזרו את תמיסות המשקיע והסירו את הפקקים מהמבחנות. הגדירו את נפח חלוקת המשקיע ל-1 µL; כאשר מפרימתי החלוקה מוחזקת במצב אנכי ביד אחת, השתמשו ביד החופשית כדי למקם את קצה המחט במרכז ובמיקום ישיר מעל בסיס הבאר.

שלב מספר אחת. לחצו על הכפתור בפיפט המכויל (repeating dispenser) כדי להוציא טיפה (bolus) של mease אל על פני השטח של הזכוכית. נפח הטיפה הוא 200 nanoliters.

כאשר משתמשים במחלק רב-פעמי סטנדרטי עם מזרק של 10 µL, קצה המחט צריך להיות במרחק של לא יותר מכמה מאות µm מעיל הבאר. כדי להבטיח הזרקה תקינה, ניתן להשיג הזרקה הדירה בקלות; הדבר דורש רק מעט תרגול. לאחר טעינת ארבע הבארות הסמוכות ב-mease, הניחו 1 µL של תמיסת משקיעה על גבי כל בולוס של mease.

בעזרת טיפים חד-פעמיים סטנדרטיים של שני מיקרוליטר לכל פטנט, ובמהירות מרבית, הניחו זכוכית כיסוי באופן מדויק מעל הבארות המלאות כדי לכסות אותן באופן אחיד ולהשיג איטום אטום למים. השתמשו בשפכץ כדי להפעיל לחץ על זכוכית הכיסוי בנקודות המגע שלה עם המשטח הדביק החשוף של סרט המרווח. ניתן לחזור על תהליך חלוקת המדידה והמשקיע עד שכל הבארות בלוח יהיו מלאות ואטומות.

הפלטה מוכנה כעת לבדיקה ולדגירה. סמנו את הפלטה בבירור לצורכי מעקב. חלבונים הרגישים לאור מטופלים בדרך כלל על ידי עטיפת הפלטות בנייר אלומיניום לפני הצבתן בתא הדגירה.

ניתן להסיר אותן ולבחון אותן תחת מיקרוסקופ בתאורה עמומה או בתאורה צבעונית מתאימה. הנח את הפלטות בתא בעל טמפרטורה מבוקרת, בדרך כלל ב-20 °C או בערך, בלוח זמנים קבוע. בדוק את הדפנות לאיתור צמיחת גבישים באמצעות מיקרוסקופ באור מקוטב עם הגדלה של 10 או 20 פעמים.

מטרה, לוח הזמנים שבו נעשה שימוש במעבדת המחבר הוא כדלקמן, ימים 0 1 2 3 5 7 14 21 30 לאחר הקיבוע. בדקו בקפידה את בולוס המדידה. התאימו את עומק המיקוד בתוך הדגימה בעובי 140 micron.

יש לבצע את הבדיקה הן באור רגיל והן בין פולריזטורים מצולבים; גבישי חלבון ממברנה חסרי צבע הגדלים בפאזה קובית נראים כך כאשר הם נצפים באור רגיל. גבישי חלבון ממברנה חסרי צבע הגדלים ב-meso נראים כך או כך כאשר הם נצפים באור מקוטב; חלבון ממברנה בעל צבע טבעי הגדל ב-meso נראה כך או כך כאשר הוא נצפה באור רגיל.

השלבים הבאים בתהליך הכולל של קביעת המבנה הם קצירה וקירור קריוגני של הגבישים, והקלטה ועיבוד של עקיפת קרני X מהם. נושאים אלו מכוסים במאמרים נפרדים של JoVE בסדרה זו.