תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle
9 בינואר 2012
Bicelles הם תערובות שומנים / amphiphile כי לשמור על חלבונים בממברנה (הפרלמנט) בתוך bilayer השומנים אבל יש שלב התנהגות ייחודית המאפשרת תפוקה גבוהה סינון על ידי רובוטים התגבשות. טכניקה זו ייצרה בהצלחה מספר ברזולוציה גבוהה מבנים משני מקורות פרוקריוטים ו האיקריוטים. וידאו זה מתאר פרוטוקולים ליצירת תערובת lipidic bicelle, המאגדת חברי פרלמנט לתוך התערובת bicelle, הקמת crystallizations ניסויים (באופן ידני, כמו גם רובוט) וקריסטלים קצירת מן המדיום.
סרטון זה ידגים שיטה להקמת ניסויי קריסטליזציה בתפוקה גבוהה של חלבוני ממברנה מנוקים באמצעות תאי Lipic B. ראשית, תאי B מוכנים על ידי ערבוב ליפיד ודטרגנט, חלבון ממברנה מנוקה מוטמע בתערובת תאי ה-B, וניסויי קריסטליזציה מבוצעים באמצעות רובוט ננוליטר ובדיקה ויזואלית. שימוש במיקרוסקופ אור סטנדרטי חושף את נוכחותם של גבישים.
לאחר היווצרותם, ניתן להוציא את גבישי החלבון ולהקפיאם לצורך איסוף נתונים וקביעת המבנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבשל התנהגות הפאזה הייחודית של B cells, ניתן להשתמש בציוד סטנדרטי וברובוטיקה הזמינים במעבדה לצורך הגבשה. שיטת Setup B cells היא טכניקה פשוטה המאפשרת להוציא את חלבון הממברנה המיועד מהמיסלה של הדטרגנט ולהעבירו למדיום ליפידי.
דבר זה מקנה לך סט חדש לחלוטין של תנאים לסריקה. זוהי שיטה כה פשוטה, אשר שימשה בהצלחה עבור חלבונים ממברנתיים רבים, עד שפשוט אין סיבה לא לנסות אותה. השלב הראשון בגיבוש (crystallization) מבוסס תאי B הוא הכנת תערובת ליפידים אמפיפית היוצרת תאי B.
תהליך זה דורש מאמץ ניכר והוא הגוזל את מרב הזמן. שימו לב כי השלמתו עשויה להימשך מספר שעות. תאי B יכולים להיווצר במגוון שילובי ליפיד-אמפיפיל ובטווח רחב של ריכוזים.
לנקודות התחלה מוצעות, עיינו בטבלה אחת בפרוטוקול הכתוב המצורף; התחילו בהכנת מיליליטר אחד של תערובת 35%DMPC capso ביחס מולרי של 2.8 ל-1. לשם כך, שקלו 0.26 גרם DMPC ו-0.09 גרם Chapo לתוך מבחנה. השלימו את הנפח ל-1.0 מיליליטר באמצעות מים דה-יוניים וערבבו את התערובת באמצעות וורטקס.
בשלב הבא, חממו את התערובת לטמפרטורה של כ-40 °C במקלחית עד שהיא תהפוך למרקם של ג'ל. הניחו את המבחנה על קרח. המדגם אמור להפוך שוב לנוזלי.
לאחר מכן, בצעו ערבוב ב-vortex שוב למשך מספר דקות, והמשיכו במחזורי החימום, הקירור והערבוב ב-vortex עד שהליפיד ימומס לחלוטין. שימו לב כי ככל שמבוצעים מחזורים רבים יותר, התערובת עלולה להפוך לעכורה עם הקירור בסיום התהליך. התערובת תהיה ג'ל צלול בטמפרטורת החדר או מעליה, ונוזל צמיגי על קרח; ניתן לשמור את התאים בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius לאחסון לטווח ארוך.
בשלב הבא, החלבונים המטוהרים מוכנסים למצע תאי B. זהו תהליך פשוט שיש לבצע באותו היום שבו מתבצעת ההתגבשת, המוצגת בחלקו הבא של הסרטון. הפשיתו את תערובת תאי ה-B של ה-DMPC בטמפרטורת החדר עד שהפאזה משתנה לג'ל שקוף.
הנח את התערובת על קרח כדי להמיס אותה, ולאחר מכן ערבב אותה קצרות ב-vortex כדי להשיב את פאזת תאי ה-B למצב הומוגני. מנקודה זו ואילך, שמור את תערובת תאי ה-B ואת החלבון המנוקה על קרח. פעולה זו תשמור את תאי ה-B בפאזה נוזלית, ובכך תאפשר את העברתם באמצעות פיפטה.
בשלב הבא, הוסיפו את תערובת תאי B לחלבון המומס בדטרגנט המטוהר ביחס של אחת לארבע, נפח לנפח. לאחר מכן, בצעו פיפוט עדין למעלה ולמטה עד שהתמיסה תהפוך לצלולה והומוגנית. אם מופיעות בועות, סובבו אותן קצרות בצנטריפוגת שולחנית כדי להסירן.
דגרו את התערובת על קרח למשך 30 דקות לפחות כדי לעודד שילוב מלא של החלבון בתאים. תערובת החלבון והתאים מוכנה כעת לניסויי התגבשות. ניסויי ההתגבשות יודגמו באמצעות רובוט התגבשות mosquito.
קררו פלטה בעלת 96 בארות עם תחתית בצורת V על ידי הנחתה על קרח. העבירו בעזרת פפיטה את תערובת החלבון והתאים אל הפלטה כדי להבטיח שצמיגות התמיסה תהיה מינימלית. שמרו את תערובת החלבון והתאים על קרח עד לשלב הסופי.
לרובוט המשמש כאן יש חמש פלטפורמות. הנח את המיקרו-פלטה המכילה את המאגר (reservoir) על פלטפורמה שלוש ואת מכסה ההתגבשות שעליו יטפטפו הטיפות על פלטפורמה חמש. לאחר מכן, הנח את פלטת החלבון המופק מתאים על פלטפורמה ארבע, הקרובה ביותר למיקום הטיפטוף.
פעולה זו מבטיחה שתערובת החלבון והתאים תהיה האחרונה שתישאר על ידי הרובוט ותשוחרר באופן מיידי. הפעל את הריצה באמצעות התוכנה; הרובוט ישאב את תמיסת המאגר ולאחריה את תערובת החלבון והתאים, ויטפטף אותן על המכסה כטיפות כדי למנוע חימום ועלייה בצמיגות במהלך החלוקה. אין לתכנת את ה-mosquito לערבב את תמיסת המאגר עם תערובת החלבון והתאים מיד עם סיום הריצה.
הוצא את פלטת חלבוני תאי הקנייה מהמכשיר והנח אותה על קרח. הסר את המכסה מהמכשיר והנח אותו על הפלטה המכילה את תמיסת המאגר כך שהטיפות יהיו הפוכות. הדגר את הפלטה בטמפרטורה של 20 °C.
שימו לב שניתן לבחון גם טמפרטורות אחרות לצורך היווצרות גבישים ואופטימיזציה. טמפרטורות גבוהות יותר משרות את הפאזה הלמינרית (lamellar phase), שיש לה את היתרון של ארגון מוקדם של החלבון בשכבות. ניתן לבצע סריקה של טמפרטורות שבין 4 °C ל-20 °C.
טמפרטורות הנמוכות מ-4 °C עלולות לגרום לשקיעה של הליפידים לאורך תקופות זמן ממושכות; ביום הראשון, השלישי ובאופן שבועי לאחר מכן, יש להעריך את מראה הגבישים ואת גדילתם באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי. מוצגות כאן תמונת שדה בהיר ותמונת UV של גבישים בצורת מחטים שנצפו בתנאי assault בלבד. לא נצפתה פלואורסצנציה מהגבישים, מה שמעיד על תוצאה חיובית שגויה בתמונה זו.
גביש בצורת מוט שנוצר כאשר methyl propane diol שימש כחומר משקיע. הגביש פולט פלואורסצנציה חלשה, מה שמעיד על כך שייתכן ומדובר בגביש חלבון, אך בדיקה באמצעות עקיפת קרני X העלתה כי הוא אינו חלבון. מוצג כאן גביש שנצפה כארבעה שבועות לאחר הקמת סדרת הניסויים.
הפלוורסצנציה החזקה תחת אור UV מאשרת כי מדובר בגביש חלבון, כפי שראיתם בסרטון זה. ברגע שתאי B זמינים, ניתן לערבב אותם ישירות עם חלבון מטוהר, ומנקודה זו תהליך ההתגבשות מתקדם כמעט בדיוק כמו בפרוטוקולים סטנדרטיים המבוססים על דטרגנטים.
יתרון בולט נוסף הוא היכולת להוסיף ליפידים ספציפיים לתאי B למטרות אופטימיזציה. קיימת ורסטיליות רבה בטכניקה זו, והיא כה פשוטה לשימוש שמומלץ לנסות אותה בכל פרויקט של גבישב חלבוני ממברנה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים שיטה להקמת ניסויי התגבשות בסביבה של תפוקה גבוהה עבור חלבוני ממברנה מטוהרים באמצעות ביסלים ליפידיים. הטכניקה מאפשרת שילוב של חלבוני ממברנה בתוך מצע ליפידי, ובכך מקלה על תהליך ההתגבשות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה מבנית
- קריסטליזציה של חלבוני ממברנה
- ביופיזיקה
רקע
- ביסלים (Bicelles) הם תערובות של ליפידים ואמפיפילים המייצבות חלבוני ממברנה בתוך שכבה ליפידית כפולה.
- טכניקה זו בעלת התנהגות פאזה ייחודית המועילה לסריקה בייעול גבוה (high-throughput screening).
- היא הניבה בהצלחה מבנים ברזולוציה גבוהה ממקורות שונים.
- ניתן להשתמש בציוד מעבדה סטנדרטי לניסיונות התגבשות.
מטרת המחקר
- להדגים את הכנת הביסלות (bicelles) לצורך גביש של חלבוני ממברנה.
- להראות כיצד לשלב חלבוני ממברנה בתערובת הביסלות.
- לתאר את תהליך הקמת ניסויי הגביש.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת ביסלים (bicelles) על ידי ערבוב ליפידים ודטרגנט.
- החדרת חלבוני ממברנה מנוקים לתערובת הביסלים.
- ניסיונות התגבשות שבוצעו באמצעות רובוט ננו-ליטר.
- בדיקה ויזואלית של הגבישים באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי.
תוצאות עיקריות
- היווצרות מוצלחת של גבישי חלבון מתערובת הביסל (bicelle mixture).
- ניתן להוציא את הגבישים ולהקפיאם לצורך איסוף נתונים.
- הטכניקה מאפשרת שימוש יעיל בציוד מעבדה סטנדרטי.
- יכולות של סריקה רחבה (High-throughput) משפרות את תהליך ההגבשה.
מסקנות
- ביסלים (Bicelles) מהווים מצע יעיל לגביש proteins של חלבוני ממברנה.
- השיטה מפשטת את המעבר של חלבונים מסביבות דטרגנטיות לסביבות ליפידיות.
- גישה זו עשויה להוביל לשיפור בקביעת המבנה של חלבוני ממברנה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
גדיש חלבונים ממברנה נותר צוואר בקבוק בגילוי תרופות מבוסס מבנה, וזאת בשל ההידרופוביות של החלבונים וחוסר היציבות שלהם במיסלים של דטרגנטים. שיטת הביסלה הליפידית (lipidic bicelle) מספקת סביבה ליפידית דמויה-טבעית יותר, המשפרת את יציבות החלבון ואת איכות הגבישים, ובכך מאפשרת קבלת נתונים מבניים מהימנים לצורך תיקוף המטרה (target validation). גישה זו תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים על ידי מתן תובנות ברזולוציה גבוהה לגבי כיסי קשירת תרופות ומצבים קונפורמציונליים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר קביעה מבנית של חלבוני ממברנה בסביבה ליפידית המשמרת טוב יותר את הקונפורמציה הטבעית ואת אתרי קישור הליגנדים.
- ערך תפעולי: מפחית את התלות בסריקה נרחבת של דטרגנטים על ידי אספקת מטריצה ליפידית סטנדרטית לניסויי התגבשות.
- ערך ניבוי: גבישים באיכות גבוהה תומכים במידול מדויק של אינטראקציות בין חלבון לליגנד, ובכך משפרים את רמת הביטחון בהשערות לגבי מעורבות המטרה (target engagement).
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר גבישים באיכות דיפרקציה המאפשרים רזולוציה ברמה אטומית עבור עיצוב תרופות מונחה מבנה.
- ערך תפעולי: תואם למערכות רובוטיות סטנדרטיות לטיפול בנוזלים בנפח ננוליטר, מה שמאפשר שילוב בקווי ייצור קיימים לקריסטליזציה בתסריע גבוה.
- יכולת הרחבה: צמיגות נמוכה של תערובות ביסל-חלבון מקלה על חלוקה אוטומטית ומפחיתה חסמים טכניים לאוטומציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מבנים שהתקבלו באמצעות התגבשות ביסלות (bicelle crystallization) מנחים את התכנון של מעכבים סלקטיביים עם פרופילים פרמקוקינטיים משופרים.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאפשר ויזואליזציה של מצבים קונפורמציונליים הרלוונטיים למודולציה אלסטרית ומנגנוני שער (gating mechanisms).
- רלוונטיות למודלים פרה-קליניים: תומך באופטימיזציה מבוססת-מבנה של תרכובות מובילות המכוונות לחלבוני ממברנה הקשורים למחלה מאורגניזמים מגוונים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
שיטת הביסלה (bicelle) משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המוליכים, ומספקת נתונים מבניים המנחים את הכימיה הרפואית ואת הבחירה של מועמדים לשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי מתן אפשרות להדמיה של ארכיטקטורת חלבוני ממברנה ואתרי קישור של ליגנדים בסביבת ליפידים הקרובה למצב הטבעי.
- סריקה: מייצר תנאי התגשמות תואמים לסריקה רובוטית, ובכך מגביר את התפוקה ואת כיסוי התנאים.
- אנליטיקה: מספק נתוני עקיפת קרני X המניבים מפות צפיפות אלקטרונים לבניית מודל מדויקת ולאימות תנוחת הליגנד.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מבנים אטומיים לבדיקות פונקציונליות, מה שמאפשר קורלציה בין זיקה של קישור לבין שינויים מבניים.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן לסטנדרטיזציה ולאחסון של פורמולציות ביסלה (Bicelle) לשימוש חוזר במספר מטרות של חלבוני ממברנה, ובכך להפחית את השונות בין הריאגנטים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: משפר את שיעור ההצלחה של קריסטליזציה של חלבוני ממברנה על ידי חיקוי סביבת השכבה הליפידית הכפולה.
- ערך תפעולי: משתמש בציוד מעבדה ורובוטיקה סטנדרטיים, ובכך מבטל את הצורך בכלים ייעודיים לטיפול בחומרים בעלי צמיגות גבוהה.
- ערך אסטרטגי: מאיץ את זיהוי המולקולות המובילות על ידי צמצום הזמן הדרוש לקבלת מבנה עבור מטרות מאתגרות של חלבוני ממברנה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות מבוססות נתונים לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על בסיס תובנות מבניות בעלות רמת ביטחון גבוהה לגבי היכולת להפוך את המטרה לניתנת לטיפול תרופתי (druggability).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בליפידים ובביוכימיה של חלבוני ממברנה כדי למטב את היחסים בין ליפידים לדטרגנטים ואת שילוב החלבונה.
- תלוי בגישה לרובוטיקה של קריסטליזציה ומערכות דגירה בטמפרטורה מבוקרת לצורך הגדרת הניסויים ומעקב אחריהם.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הכנת הביסלות (bicelle) בין הצוותים השונים כדי להבטיח שחזור של תוצאות הקריסטליזציה.
- כולל אופטימיזציה של הרכב הליפידים (למשל, יחסי DMPC:CHAPSO) וסריקת משקיעים כדי להתאים לצרכי הקריסטליזציה הספציפיים של החלבונה.
- מוגבל בשל הצורך בטיפול בקירור במהלך ההכנה כדי לשמור על נזילות הביסלות ולמנוע מעברים מוקדמים בין פאזות.
