הערכת דו מימדי ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה קטנים ללימודי לביולוגיה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות את תנאי הגבישה הדו-ממדיים (2D) האופטימליים ביותר לקביעת המבנה של חלבוני ממברנה באמצעות גבישה אלקטרונית. זאת מושגים תחילה על ידי שימוש בדטרגנט תואם במהלך הטיהור כדי להמיס את החלבון מהשכבה הליפידית הטבעית. השלב השני של ההליך הוא הוספת ליפידים חיצוניים והסרת הדטרגנט באמצעות דיאליזה של תערובת החלבון, הליפיד והדטרגנט, מה שמוביל להיווצרות גבישי 2D תחת תנאים מבוקרים בקפידה.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הקפאה מהירה (flash freeze) של הדגימות למצב זכוכיתי. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא איסוף נתונים באמצעות cryo em. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות שמעניקות את המבנה הסופי של החלבון באמצעות עיבוד תמונה חישובי של הנתונים.

שלום, אני מהמעבדה. אני מבית הספר לביולוגיה במכון ג'ורג'יה לטכנולוגיה. שלום, אני טינה דרדד.

אני ממעבדת Berry בבית הספר לכימיה וביוכימיה וממעבדת Schmidt Kray בבית הספר לביולוגיה במכון ג'ורג'יה לטכנולוגיה. ואני מאט ג'ונסון מהמעבדה של אינגלבורג שמיד קריי בבית הספר לביולוגיה במכון ג'ורגיה לטכנולוגיה. היום נראה לכם פרוצדורה להערכת ניסויי קולו-ניצמנה דו-ממדיים באמצעות EM.

אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדתנו כדי לזהות ולבצע אופטימיזציה לתנאי גיבוש דו-ממדיים (2D crystallization). אם כן, נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, מכינים דגימות בצביעה שלילית על גבי רשתות נחושת עם ציפוי פחמן בנוריות של 400 למיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM). טפטפו 2 µL מדגימת הפרוטאו-ליפוזום תחת רשת TEM מצופה פחמן והדגרירו למשך 60 שניות.

אם הדגימה אינה מתפזרת באופן אחיד, החליקו אותה בעדינות עם דופן קצה הפ pipette. לאחר מכן, חסמו את השוליים באמצעות פיסת נייר סינון watman מספר 4 קרועה. פעולה זו מבטיחה הסרה אופטימלית של הנוזל ללא הסרה מוגברת של ליפוזומים של protea, ומסייעת בשימור שכבת הפחמן העדינה.

מיד לאחר הספיגה, יש להחיל שני מיקרוליטרים של צבע uranyl acetate בריכוז 1% לאחר 30 שניות, ולספוג מהקצה של הרשת. שוב, אם הדגימה מכילה ריכוזים גבוהים של גליצרין או סוכרוז צמיגיים, בדרך כלל בטווח של 10 עד 20%, מספר מחזורי שטיפה של הרשת עם באפר נטול גליצרין או סוכרוז לפני הצביעה השלילית עשויים לסייע להשגת צביעה תקינה עם תמיסת ה-uranyl acetate.

לאחר הכנת הרשתות, נעשה שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית כדי להדמיות של הדגימה בהגדלה נמוכה, במטרה להעריך את התהלוּת והפיזור של הממברנות, את המורפולוגיה שלהן ואת איכות הרשת הכללית. לאחר מכן, נעשה שימוש בהגדלה גבוהה כדי להשיג תמונות ולבצע טרנספורמציות RIA לתמונות לצורך זיהוי גבישים דו-ממדיים (2D crystals). כדי להתחיל, הכניסו את הרשת לתו transducer של המיקרוסקופ האלקטרוני; כדי לקבל התרשמות ראשונית מהפיזור הממוצע של הממברנות, השתמשו בהגדלה בינונית של 2000 עד 10,000 x.

יש לרשום במחברת מעבדה את היקף הפצתו של הממברנות, את המורפולוגיה שלהן ואת גודלן. יש לתעד תמונות מייצגות באמצעות מצלמת CCD. לאחר מכן, במידת הצורך, יש לבחון את הדגימות בהגדלה נמוכה בטווח של בערך 400 עד 800 x כדי לקבל סקירה כללית של הרשתות.

פעולה זו יכולה לספק מידע בעל ערך להערכת הכנת הרשת על ידי חשיפת בעיות בריכוז הדגימה, חלבוני פרוטאה לא אחידים, פיזור ליפוזומים ושבירה חלקית של שכבת הפחמן. זהה אזור עניין ברשת בהגדלה נמוכה או בינונית. לאחר מכן, השתמש בהגדלה גבוהה כדי להעריך סדר אפשרי בממברנות השונות.

שלב זה הוא קריטי בשלבים מוקדמים של ניסיונות גבישה דו-ממדית (2D). על מנת לזהות ליפוזומים של חלבונים מבטיחים בעלי אזורים מסודרים היטב, ולהבטיח הדירות בניסויים מאוחרים יותר לקביעת הגדרת ההגדלה הגבוהה האופטימלית לסריקת גבישים דו-ממדיים, התחילו עם הגדלה שבין 50,000 ל-60,000 x. בהתאם לממדי הגביש הדו-ממדי ולגודל תא היחידה, ניתן להוריד את הגדרת ההגדלה הגבוהה עד ל-30,000 או להעלותה עד ל-80,000.

כאן, במיקום סמוך לאזור העניין בתמונה, נבצע דה-פוקוס (defocus) של כמינוס 400 nanometers או יותר אם קיים ספק לגבי השאלה האם אזור העניין הוא אכן ממברנה. יש לבחון את הדגימה לאיתור חלקיקי סרט פחמן, MICA או ארטיפקטים אחרים שעלולים להיחשב בטעות עבור פרוטאו-ליפוזומים. כמו כן, יש לבחון את הקצוות כדי להבחין בקיפולי ממברנה ובמורפולוגיה טיפוסיים.

בשלב הבא, בחנו את האזור המדובר באמצעות מצלמת CCD. בעת איסוף תמונת CCD בהגדרת הגדלה מקסימלית אופטימלית, ייתכן שסריג של חלבון ממברנה קטן ו/או הידרופובי ברובו לא יהיה ניתן לזיהוי באמצעות הערכה חזותית של תמונת ה-CCD עצמה. במקרה זה, התמונה כולה משמשת לביצוע התמרת פורייה (Fourier transform או ft) מקוונת.

עם זאת, אם המערך המסודר קטן, התמרור פורירי (FT) הזה יכיל כמות משמעותית של רעש. כדי לשפר את יחס האות לרעש, הקטינו את גודל התמונה הממוסגרת, הזריזו את המסגרת המוקטנת מעל התמונה, ובצעו FT חי; התאימו את פונקציית הגמא של ה-FT החי לזיהוי אופטימלי של מערכים מסודרים. ערך גמא גבוה מדי עלול להסתיר נקודות עקב תרומות של רעש, בעוד שערך נמוך מדי ימנע זיהוי של נקודות חלשות יותר. צפו כי רזולוציית הגבישים הדו-ממדיים בצביעה שלילית תהיה בערך 15 angstroms ב-DFO של מינוס 400 nanometers.

צפוי לזהות בין סדרה אחת לשלוש של נקודות. שימו לב לחדות הנקודות ולכל דפוס פסיפס (mosaic). גבישי 2D של חלבון ממברנה קטן בגודל 18 kilodalton מגיעים לגודל של מספר מיקרונים.

נקודות חדות על ה-FTS ותנועה שניתן לזהות בקלות של תיבת ה-FT החיה מעידות על כך שהסריג הוא רציף וללא פסיפס (mosaic). ניתן לזהות את הסריג של חלבון גדול יותר בעל דומיין מסיס נרחב יותר על המסך הקטן של איסוף תמונות ה-T-E-M-C-C-D, ו-FT נחוצים כדי לקבל הערכה טובה יותר של איכות הסריג, כולל מאפיינים כגון רעש פסיפס ב-FT של חלבון לא מסודר. ליפוזומים עלולים להיתפס בטעות כנקודות חלשות; יש לקבוע האם הנקודות נובעות מקריסטלים דו-ממדיים של חלבון קטן או מרעש.

הזיזו את הקופסה עבור ה-live ft. אם הנקודות נעלמות מיד, מדובר ברעש, אך אם הן נותרות ללא שינוי אפילו על פני שטח קטן, סביר להניח שקיימים גבישים, מכיוון שגבישי ליפידים מציגים מורפולוגיה ו-ft מובחנים. ניתן לזהות גבישי ליפידים אלו גם באמצעות בדיקה ויזואלית של תמונה וגדלי תא יחידה עקביים.

בניסויים ראשוניים עלולה להתרחש שקיעה. בדיקה בהגדלה גבוהה משמשת להבחנה בין שקיעת חלבונים לבין אגרגטים של ליפידים. במקרה של אגרגטים של ליפידים, ייתכן שreconstitution אכן התרחש, והניסויים הבאים ידרשו רק התאמה של הפרמטרים הנחוצים להגדלת גודל הממברנה וליצירת סדר, במקום להשרות reconstitution ב-30,000 עד 50,000 x.

קצותיהם של מבנים כהים אלו חושפים כי הם מורכבים מממברנות ללא חלבון. דגימות שקיעה בתנאים אופטימליים יכילו אחוז גבוה של גבישים דו-ממדיים (2D). אין צורך לשאוף למראה הומוגני של הממברנות, שכן הגבישים הדו-ממדיים הגדולים והמסודרים ביותר נבחרים באופן ויזואלי לצורך איסוף נתונים.

סוגים אלו של דגימות יזוהו בקלות כאשר ההתגבשות של דגימות כאלו משמשת לאיסוף נתונים ב-cryo EM כדי להשיג את המספר המקסימלי של תמונות ברזולוציה גבוהה. נדגים לכם כיצד לבצע סריקה של גבישים דו-ממדיים של חלבוני זיכרון קטנים באמצעות TEM בעת ביצוע הליך זה. חשוב לזכור להיות יסודיים כדי לא להחמיץ תנאי התגבשות מבטיח, שכן כבר השקעתם כמות משמעותית של זמן ומאמץ עד לנקודה זו.

זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.