הפעל מחדש ישיר של מזלג שכפול בדמותה של פולימראז RNA חזיתית

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון את גורלם של אזור השכפול (Repli zone) ושל RNA polymerase או RNAP בעקבות התנגשות חזיתית. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הרכבת קומפלקס השעתוק על DNA ביוטינילי וקיבועו על לוחית Stripp וחרוצים, דבר שיוביל לקומפלקס הארכה של RNAP במצב עצירה. השלב השני של הפרוצדורה הוא ליגציה של DNA מזלג מוכן אל קומפלקס ההארכה של ה-RNAP, כדי ליצור מזלג שכפול במורד ה-RNAP שהתנגש חזיתית.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הרכבת אזור השכפול (repli zone) והתחלת סינתזת הגדיל המוביל במזלג השכפול. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא בידוד ה-DNA מהחרוזים המגנטיים וטיהור ה-DNA באמצעות עמודת ניקוי PCR. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי ה-roso נעצר בעקבות התנגשות עם קומפלקס תעתוק ראש בראש, זאת באמצעות ג'ל אגרוז alkaline של תוצרי ה-DNA המסומנים רדיואקטיבית המטוהרים.

שלום, אני ריצ'רד פומרנס מהמעבדה של מייק אודונל באוניברסיטת רוקפלר. היום אדגים לכם את הפרוצדורה לביצוע התנגשות של הריבוזום עם RNA polymerase במצב מוצק. אני משתמש בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד תהליך השכפול מושפע מקומפלקסי טרנסקריפציה לאורך ה-DNA.

בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, ערבבו RNAP holo enzyme עם תבנית DNA biotinylated בגודל 3.6 KB המכילה את ה-T seven A one promoter ב-100 µL של buffer a. דגרו את התערובת למשך 10 דקות ב-37 °C. לאחר דגור של 10 דקות, הוסיפו ribonucleotides adenosine, tri phosphate, cytidine phosphate, ו-Aden allele uridine, אשר יגבילו את סינתזת ה-RNA ל-20 נוקליאוטידים.

דגרו את התמיסה למשך 10 דקות נוספות ב-37 degrees Celsius כדי לקבע את קומפלקס ההארכה של RN ape שהופסק על גבי חרו지를. הוסיפו את התמיסה לחרוזים מגנטיים מצופים בסטרפטאווידין. השאירו את התערובת לדגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

טהרו את קומפלקס הארכה של ה-RNAP המעוכב והמקובע על ידי שטיפת החרו지를 ב-0.9 milliliters של בופר מלח גבוה. כדי להסיר קומפלקסים לא ספציפיים של R-N-A-P-D-N-A לאחר כל שטיפה, הסירו את supernatant באמצעות הפרדה מגנטית. יש לחזור על שטיפה זו חמש פעמים.

לאחר מכן יש לשטוף את החרוזים פעמיים נוספות עם 0.9 milliliters של באפר A. לאחר השטיפה הסופית, ניתן להרכיב מזלג רפליקציה במורד הזרם כדי ליצור מזלג רפליקציה במורד הזרם של RNAP שנע במנוגד (head-On). השעה את רצועת המגנט כדי להביא את החרוזים הקשורים למכלול השחלוף של הארכה של RNAP שהופסק ב-100 microliters של באפר 4 של New England Biolabs. לאחר מכן, הוסף 10 units של פוספטאז שרימפס בסיסי או SAP, והדגר את הדגימה למשך 10 דקות ב-37 degrees Celsius. שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 0.9 milliliters של באפר A. לאחר מכן, השעה שוב את החרוזים ב-50 microliters של באפר תגובת ליגציה Quick T4.

הוסיפו שני מיקרוליטרים של quick T4 ligase ו-DNA מזלג שנוצר מראש, והדגירו את התמיסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שטפו את החרוזים שלוש פעמים נוספות עם 0.9 מיליליטרים של buffer A. ערבבו hexamer, DNA helicase עם ה-magnetic strep A והחרוזים המחוברים למערך ה-RNAP elongation המעוכב ולמזלג השכפול במורד הזרם. הכינו את התמיסה ב-150 מיקרוליטרים של buffer A והדגירו אותה למשך 30 שניות ב-23 מעלות צלזיוס.

לאחר דגירה קצרה של 32 דקות ב-23 degrees Celsius, הוסיפו polymerase three beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P, DGTP מסומן ב-alpha P 32 ו-DATP מסומן ב-alpha P 32 עד לנפח של 200 microliters. דגרו את הדגימה למשך חמש דקות ב-37 degrees Celsius.

התחילו את השכפול על ידי הוספת חלבון קושר DNA לחוט בודד, DCTP ו-DTTP. הוסיפו גם alpha P 32, DTTP ו-DCTP מסומנים, עד לנפח סופי של 250 µL. לאחר 10 דקות, הפסיקו את התגובות על ידי הוספת 12 µL של EDTA בריכוז 0.5 M.

בשלב הבא, הרתיחו את חרוזי ה-strp din כדי לשחרר את ה-DNA מהחרוזים. הסירו שאריות DNA על ידי טיפול בחרוזים ב-proteinase K למשך 30 דקות ב-50 °C. הרתיחו את החרוזים שוב והסירו את הנוזל העליון באמצעות הפרדה מגנטית.

טהרו את העילאי המאוחד המכיל את ה-DNA באמצעות ערכת Kyogen PCR cleanup. לבסוף, נתחו את תוצרי ה-DNA המסומנים רדיואקטיבית בגל אלקלין אגרוז. התנגשות של האזור עם RNAP מקדימה מביאה בדרך כלל לשני תוצרים באורך 2.5 KB ו-3.6 KB. התוצר באורך 2.5 KB מייצג את אורך ה-DNA מהמזלג ועד ל-RNAP שעצר.

תוצאה זו נובעת מעצירה של השכפול בעקבות התנגשות עם ה-RNAP. המוצר בגודל 3.6 KB מייצג DNA באורך מלא, והוא תוצאה של תפיסה חלקית של הפרומוטור על ידי ה-RNAP או מעבר חלקי של השכפול דרך ה-RNAP במצב של התנגשות חזיתית (head-on). תוצאה טובה מדגימה כי נוצר DNA באורך מלא בכמות של כ-50%.

עם זאת, במקרים מסוימים, תתרחש תפיסה נמוכה יותר של הפרומוטור על ידי RNAP וייצפה אחוז גבוה יותר של DNA באורך מלא. זאת מכיוון שאוכלוסייה גדולה יותר של אזורי רפליקציה אינה נתקלת ברפליקציה של RNAP במפגש חזיתי; בהיעדר RNAP שנעצר, תיווצר רק DNA באורך מלא. הרגע הצגנו כיצד לבצע רפליקציה במוצק (solid phase) בנוכחות קומפלקס הארכה של RNA פולימראז שנעצר וקשור ל-DNA. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשטוף את קומפלקס התעתוק שנעצר במלח בריכוז גבוה כדי להסיר RNA פולימראז עודף, הנקשר ל-DNA באופן לא ספציפי ומעכב את הרפליקציה.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.