Patterned Photostimulation עם התקנים דיגיטליים Micromirror לחקור שילוב דנדריטים מעבר סניף נקודות

המטרה הכללית של הליך זה היא לשלוט בתבניות אור מורכבות בזמן ובמרחב, כך שניתן יהיה להשתמש בהן לגירוי של נוירונים. דבר זה מושג תחילה על ידי מיקום של שבב DMD במישור תמונה צמוד מתאים במסלול האופטי של המיקרוסקופ. השלב השני של ההליך הוא הארה נכונה של ה-DMD באמצעות מקור אור עז, כגון לייזר.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביטול אפקט הנימוקים (speckling) של תאורה קוהרנטית. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא שילוב של ממשק משתמש גרפי לשליטה בשבב ה-DMD. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי ניסויים שבעבר היו קשים לביצוע, ניתנים כעת להשלמה בקלות יחסית באמצעות ליזיס רב-אתרית של נוירוטרנסמיטור כלוב תוך שימוש במערכת ה-DMD.

שלום, אני מייקל מוחמד מהמעבדה של ד"ר צ'מן טאנג במחלקה לנוירולוגיה באוניברסיטת מרילנד. היום נדגים לכם פרוצדורה ליצירת תבניות מורכבות של אלימינציה במיקרוסקופ אופטי. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור אינטגרציה דנדריטית.

אם כן, נתחיל. פרוטוקול זה ידגים את התפעול של מערכת תאורה המבוססת על התקן מראות מיקרוסקופיות דיגיטליות, או DMD, עבור נוירו-מדע ניסויי. DMD הוא שבב מוליך למחצה אופטי עם כמה מאות אלפי מראות מיקרוסקופיות נידונות המסודרות במערך מלבני על פניו, כאשר מיקומו של כל מראה תואם לפיקסל בתמונה.

ניתן לשלוט בכל מראה באופן פרטני כדי להטות אותה בין שתי אוריינטציות. באוריינטציית ה-"כבוי" (off), האור מופנה הרחק מהציר האופטי של הארת הדגימה. באוריינטציית ה-"פועל" (on), האור מופנה לאורך הציר האופטי.

DMD מתאים מאוד לליזיס מכיוון שהוא עמיד לאור UV עז מאוד, מייצר יחסי ניגודיות גבוהים בין פיקסלים במצב פעיל (on) למצב כבוי (off), ויכול להחליף בין שני המצבים בתוך עשרות מיקרו-שניות. היישום של DMDs במחקר ביו-רפואי נסייע על ידי השימוש הנרחב בתוכנות ובחומרה למניפולציה של תמונות, ועל ידי עניין מסחרי בתחום תצוגת התמונות. רכיבים מודולריים משווקים על ידי Texas Instruments כערכות DLP discovery המספקות את מנהלי הדרייברים האלקטרוניים התומכים להתאמת ה-DMD למערכת מיקרוסקופית.

יש להבין את מושגי היסוד הנוגעים לאופטיקה של מיקרוסקופיה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מודרני בסיסי מורכב מנתיב דימוי ומנתיב הארה. הוא כולל עדשה אובייקטיבית, קוביית מסננים ושתי עדשות צינור נפרדות עבור נתיב הדימוי ונתיב ההארה.

המיקרוסקופ תוכנן כך שיהיו לו מישורים הצמודים למישור התמונה של הדגימה, כך שאובייקטים הנמצאים במיקוס במישור הדגימה ייראו במיקוס גם במישורי התמונה הצמודים הללו. נובע מכך שכל תמונה בהירה שייווצר במישור התמונה הצמוד תוקרן באופן חד למישור התמונה של הדגימה. אסטרטגיה זו משמשת להקרנת תבנית הארה שנוצרה במחשב על גבי הדגימה.

קרן הלייזר משמשת כמקור אור בהיר מאוד שיאיר את התבנית המיושמת על ידי המראות המיקרוסקופיות בשבבי ה-DMD הממוקמים במישור תמונה צמוד (conjugate image plane). תכנונו של מערכת תאורת DMD תלוי באורות העירור המשמשים בניסויי אופטוגנטיקה, המשתמשים באור באורך גל נראה. ניתן להעביר את התבנית המוארת דרך נתיב המצלמה.

לפיכך, ניתן להרכיב את שבב ה-DMD פשוט על אחד משני פתחי המצלמה של מודול בעל פתחי מצלמה כפולים. לעומת זאת, עבור ניסויים המשתמשים באור בטווח ה-UV, כגון ליזיס של תרכובות כלובות (caged compounds), יש להעביר את האור דרך נתיב התאורה האפי (epi illumination) וליצור מישור תמונה צמוד (conjugate image plane) נגיש יותר. זאת מכיוון שעדשת צינור הדמיה אינה מתוכננת להעברת UV.

במקום זאת, עדשת צינור ההארה משמשת להעברת UV ומבצעת עבודה מספקת ביצירת הדמות. כל מיקרו-מראה ב-DMD יכול להחליף בין הטיה חיובית לשלילית של 12 מעלות ביחס למישור השבב. בהתאם לקלט הדיגיטלי שהיא מקבלת מהמחשב, ציר הסיבוב הוא לאורך הפינות האלכסוניות של כל מראה, בזווית של 45 מעלות לדפנות המלבניות של השבב.

כיוון הטיית המראה מסומן על ידי משולש בצבע זהב בפינה אחת של פני השטח הקדמיים של השבב. הטיית המיקרו-מראה קובעת את היישור של ה-pitch וה-azimuth של קרן התאורה הנכנסת. כדי להאיר את ה-DMD, הגדרו תחילה את ה-pitch של קרן התאורה ל-24 מעלות מהציר הניצב של שבב ה-DMD, והגדירו את ה-azimuth להיות ניצב לציר סיבוב המראה.

יישור מדויק של הקרן הוא קריטי לתפעול יעיל. עבור ניסויי ליזיס, השתמש במקור לייזר כדי ליצור את הקרן הממוקדת בעלת העוצמה הגבוהה הדרושה לשחרור מהיר (uncaging).

בניסוי זה נעשה שימוש בלייזר Nd:YAG בעל תדר משולש, במצב מוצק הנשמר על ידי דיודה ובעל פעולה רציפה-כמעט; נעשה שימוש בלייזר בעל הספק גבוה יחסית מכיוון שרק חלק קטן מפלט הלייזר מגיע בפועל לדגימה. בעת שימוש במערכת DMD, יש להזרים את פלט הלייזר לסיב אופטי רב-מודים (multi-mode fiber), כך שניתן יהיה למקם ולהכווין אותו בקלות לאורך הציר הנכון להארת ה-DMD, וזאת כדי לספק פתרון לבעיית הספקל (speckle) הנוצרת מהארה קוהרנטית; העבירו את האור דרך הסיב האופטי.

הסיב מלופף סביב מותח סיבים פייזו-אלקטרי המונע לתת לו תנודות בתדר של כ-40 kilohertz. המתיחה המיקרוסקופית של הסיב מספיקה כדי להזיז את תבנית הספקל פעמים רבות במהלך משך המילי-שנייה של כל פולס של גירוי פוטוני, ובכך היא מבטלת ביעילות את השפעת הספקל. לבסוף, הפלט של הסיב האופטי מרוכז באמצעות עדשת מיקרוסקופ UV כדי להאיר את ה-DMDs לצורך ביצוע רישום משותף (coregistration) של פיקסל ה-CCD עם תוכנת התמונה של ה-DMD, אשר מקשרת בין מראות DMD בודדות לפיקסלים ספציפיים במצלמת ה-CCD המשמשת לדימוי.

ממשק המשתמש הגרפי בתוכנה מאפשר למשתמש להגדיר את אוריינטציית מראת ה-DMD התואמת לאזור בתמונת ה-CCD באמצעות עכבר המחשב. סמנו את המיקום לגירוי פוטוני על ידי הזזת הסמן מעל התמונה המוצגת על מסך המחשב, ולחצו על אזור העניין המסומן כדי לתכנת את מאגר תבניות הולכת האור. התבנית המסומנת על מסך המחשב כסדרה של תמונות נפרדות מתכנתת בתוכנה את תזמון פולסי הלייזר עבור כל תבנית מרחבית.

מערכת זו תעבוד בסינכרון עם תוכנת רכישת הנתונים P clamp. לסיום, השתמש בתוכנת רכישת הנתונים כדי לתאם את תזמון האלקטרוניקה של ה-DMD, את סגירת הלייזר (gating) ואת רכישת האות החשמלי בשיטת patch clamp מהנוירון המטרה. כאן מוצגת כיול של רזולוציית המערכת האופטית.

גודל הכתם המינימלי מוצג כפי שנמדד ממטרה פלואורסצנטית. הרזולוציה הפיזיולוגית האפקטיבית נמדדת על ידי אמפליטודת זרימת הזרם כפונקציה של סטימולציה פוטונית. מיקום הכתם כאן: גלוטמט כלוא (caged glutamate) הופעל פוטונית בסמוך לענף דנדריטי בעל קוטר של 2 µm.

בעוד שהנקודה הוזזה, מוצגות תגובות חשמליות לגירוי אורית בעצימויות שונות, באופן אורתוגונלי לרוחב ה-dite. מוצגות תגובות תחת קיבוע מתח (Voltage clamped) כפונקציה של עצימות הליזה.

ניתן ליישם בקלות גרייה דנדריטית מפוזרת באמצעות מערכת מבוססת DMD. כאן, עוצמת הקלט שונתה על ידי הגדלת מספר נקודות הגירוי הפוטוני המסומנות כעיגולים בשני הענפים הדנדריטיים. סיכום מרחבי יכול להיות לא-ליניארי על פני נקודות פיצול של ענפים.

המענה הופך לסופר-ליניארי יותר ככל שגוברות אמפליטודות הקלט המגיעות לשני ענפי הדלת. תוצאות אלו ממחישות בבירור את האופן הלא-ליניארי של הסיכום בנקודות פיצול של דנדריטים. הסופר-ליניאריות מתווכת במידה רבה על ידי קולטני NMDA ולא על ידי תעלות תלויות-מתח.

ניתן להדגים זאת באמצעות יישום של שני אנטגוניסטים ל-NMDA; APV ו-MK 801 מבטלים במידה רבה את ההתנהגות הלא-ליניארית. הרגע הצגנו את התכנון והתפעול הבסיסיים של מערכת המבוססת על DMD עבור פוטו-סטימולציה של תבניות ברקמה עצבית. ניתן להתאים את המערכת לגירוי באמצעות אור נראה, כפי שנעשה בניסויי אופטוגנטיקה.

ניתן להתאימו גם לאור UV קרוב כפי שנעשה בליזיס של פוטון בודד. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שאם נעשה שימוש באור באורך גל קטן מ-400 nanometers ורוב האנשים מעבירים אותו דרך נתיב התאורה האפי, היישור המדויק של קרן התאורה בטווח של מספר מעלות הוא קריטי, ואם נעשה שימוש באור קוהרהנטי, יש לבטל ביעילות את תופעת הנקודות (speckling). זהו כל הפרוצדורה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.