שיחקרו את ההשפעות של מטריקס נוקשות על פונקציה נייד באמצעות Acrylamide מבוססי הידרוג

למידול גמישות רקמות in vivo באמצעות הידרוג'לים של אקרילאמיד. הדבר מבוצע תחילה על ידי יצירת לוחות כיסוי תחתונים ריאקטיביים ולוחות כיסוי עליונים סיליקוניים. השלב השני של הפרוטוקול הוא מזיגה ויצירה של הידרוג'לים של אקרילאמיד.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא קישור צולב (cross-linking) של חלבון המטריצה החוץ-תאית הנבחר להידרוג'ל. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא אינקובציה ואנליזה של תאים. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות כיצד שינוי בגמישות המטריצה החוץ-תאית in vitro מווסת את התנהגות התאים, וזאת באמצעות אנליזה המשתמשת במיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה, qPCR כמותי בזמן אמת ו-western blotting.

היום נראה לכם את הפרוצדורה להכנה ולשימוש בהידרוג'לים של אקרילאמיד. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד קשיחות המטריצה החוץ-תאית מווסתת מורפולוגיה של תאים, איתות תאי ופרוליפרציה. אז בואו נתחיל.

התחילו הליך זה על ידי הכנת זכוכיות כיסוי (cover slips) רהאקטיביות. ראשית, הניחו שכבה של פאראפילם (parafilm) על החלק התחתון של צלחת פטרי בקוטר 150 מילימטר. לאחר מכן, העבירו עד תשע זכוכיות כיסוי שעברו אוטוקלב בקוטר 25 מילימטר אל הפאראפילם וכסו אותן ב-1 מיליליטר של נתרן הידרוקסיד בריכוז 0.1 מולרי.

דגרו את לבישי הזכוכית למשך שלוש דקות. לאחר הדגירה, שאבו את נתרבית ההידרוקסיד באמצעות קו ואקום העובד בתוך מנדף כימי. טפטפו 0.5 milliliters של 3-aminopropyltrimethoxysilane או 3-APTMS על כל לביש זכוכית. דגרו את לבישי הזכוכית למשך שלוש דקות ולאחר מכן שאבו את ה-3-APTMS. היזהרו לא לדגור זמן רב מדי כדי למנוע היווצרות קצף על הלביש.

זכוכיות כיסוי לאחר הטיפול. שטפו את זכוכיות הכיסוי פעם אחת עם 20 milliliters של מים דה-יוניים באותה צלחת. הוציאו את זכוכיות הכיסוי מהצלחת באמצעות פינצטה קמורה והעבירו אותן, כאשר הצד המטופל פונה כלפי מעלה, לצלחת חדשה של 150 millimeter.

לאחר מכן, שטפו שוב את לביבות הכיסוי במים דה-יוניים והניחו אותן על השייקר (rocker) למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, הסירו את המים ושטפו פעמיים נוספות. חשוב מאוד להסיר את כל ה-A-P-T-M-S כדי שלא יגיב עם הגלוטראלהיד ויגרום להיווצרות משקוב לבן ועכור 10 דקות לפני השימוש בגלוטראלהיד.

בעזרת פינצטה קמורה, העבירו את לוחות הכיסוי לצלוחית נקייה המצופה ב-param ושאיפו כל נוזל שנותר באמצעות קו ואקום, ולאחר מכן כסו כל לוח כיסוי לחלוטין ב-0.5 milliliters של 0.5%glutaraldehyde במים דה-יוניים סטריליים כדי ליצור קשרי צלב בין ה-A-P-T-M-S לבין ג'ל הפולי-אקרילאמיד. דגרו את לוחות הכיסוי למשך 30 דקות במנדף כימי. לאחר מכן, שאיפו את שטיפת ה-glutaraldehyde ושטפו שוב את לוחות הכיסוי במים דה-יוניים.

לאחר מכן ייבשו את הזכוכיות המכסות לחלוטין. העבירו זכוכיות מכסות חדשות לפביאלקון (Falcon) בנפח 50 מיליליטר המכיל תמיסת surface seal בריכוז 10% בתוך כלורופורמיל, וטלטלו בעדינות במשך 10 דקות לפחות. שפכו את תמיסת ה-surface seal וייבשו באוויר.

הניחו את לביבות הכיסוי על מגבוטי Kim בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית שבה יוכנו ההידרוגלים, כדי להתחיל בהכנת ההידרוגלים. השתמשו בפינצטה מעוקלת כדי להעביר את לביבות הכיסוי, כאשר הצד הריאקטיבי פונה כלפי מעלה, לדף פאראפילם שהודבק למשטח של קבינת הבטיחות הביולוגית. ודאו שלביבות הכיסוי מונחות בצורה שטוחה על פני שטח הפאראפילם.

לאחר מכן, הכין תמיסה רוויה של NHS בטולואן על ידי המסת כמות קטנה של NHS בכמות מספיקה של טולואן. עבור ניסויים ספציפיים, הוסף כמויות קטנות של NHS עד ש-NHS כבר אינו נמס. התמיסה הרוויה היא בדרך כלל עכורה וורודה.

בשלב הבא, הכינו את תמיסת האקרילאמיד, ה-BIS-אקרילאמיד והמים, והוסיפו PS כדי להגיע לאחוז האקרילאמיד הרצוי. הוסיפו את הריאגנטים לשפופרות המיקרוסנטריפוגה כמפורט בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, חלקו את התמיסות לאליקוטים, אחד בכל פעם.

הוסיפו את ה-NHS וה-TM. ערבלו את המבחנה ב-Vortex למשך זמן קצר ושפכו מיד בין שלושה לחמישה ג'לים, תוך שימוש ב-140 microliters לכל זכוכית כיסוי, בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית. הניחו במהירות את זכוכית הכיסוי ה-SILICONIZED בגודל 25 millimeter מעל לכל ג'ל לפני תחילת הפולימריזציה.

הוספת כיסוי הזכוכית העליון תאפשר לאקרילאמיד לכסות לחלוטין את כיסוי הזכוכית התחתון. דגרו "סנדוויץ'" זה בטמפרטורת החדר עד לפולימריזציה של האקרילאמיד; כדי לקבוע מתי התרחשה הפולימריזציה, בדקו את תמיסת האקרילאמיד שנותרה במבחורת המיקרו-צנטריפוגה.

הפולימריזציה תימשך מספר דקות עבור ג'לים קשיחים וזמן מעט ארוך יותר עבור ג'לים רכים. לאחר השתלמות הפולימריזציה, הרימו בזהירות את ה"סנדוויץ'" תוךempre לבישת כפפות סטריליות. לאחר מכן, החליקו את כיסוי הזכוכית העליון עד שיבלוט מעל הג'ל שעבר פולימריזציה.

לאחר מכן, פתחו את הכיסוי. הסירו את הג'ל והשליכו את כיסוי הזכוכית העליון. העבירו כל כיסוי ג'ל תחתון, אשר ייקרא מכאן הלאה הידרוג'ל, לפלטה בעלת שישה בארות.

בשלב הבא, הוסיפו שני מיליליטר של phosphate buffered saline או PBS לכל באער בלוח של שישה באערים. לאחר מכן, שטפו את ההידרוגלים ב-PBS והדגירו אותם על רוקר למשך חמש דקות. חזרו על שטיפה זו פעמיים.

כדי להתחיל את הניסוי, כסו כל הידרוג'ל בשני מיליליטר של תמיסת פיברונקטין או חלבון אחר של המטריקס החוץ-תאי. דגרו את החלבון על ההידרוג'ל למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר לו להיקשר קוולנטית להידרוג'ל; לאחר הדגירה למשך הלילה, שאבו את תמיסת ה-ECM. לאחר מכן, חסמו את ה-NHS שאינו מגיב באמצעות מיליגרם אחד למiliליטר של אלבומין משרת בקר ללא חומצות שומן המופעל בחום, במצע נטול סרום, ודגרו למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, שטפו את ההידרוג'לים פעם אחת ב-PBS סטרילי. לאחר מכן, זרעו את התאים במצע גידול מתאים המכיל סרום בקר עוברי. יש לזרע אותם על גבי ההידרוג'ל.

נעשה שימוש בפיברובלסטים עובריים של עכבר. קבע את מספר התאים שיזרעו על ההידרוג'ל בהתבסס על מידת פריסת התאים וההצפיפות (confluence) הנדרשת לניסוי. עבור אנליזת western blot ו-quantitative PCR נדרשים כ-10⁵ תאים.

לאחר מכן, דגרו את התאים בתנאים המתאימים לסוג התא הספציפי. בתום תקופת הדגירה, הוציאו את חלבוני התא או את ה-mRNA בהתאם לצורך.

טפטפו 100 µL של תמיסת ליזיס (lysis buffer) על גבי דף פאראפילם שמונח על השולחן במעבדה, תוך השארת רווח של כשני עד שלושה סנטימטרים בין כל טיפה. לאחר מכן, הוציאו בזהירות כל הידרוג'ל על ידי הרמת כיסוי הזכוכית התחתון מהבאר. השתמשו בפינצטה מעוקלת והניחו את צד התאים כלפי מטה על גבי הטיפות.

דגרו את התאים עם תמיסת הליזה למשך דקה אחת בדיוק. לבסוף, הסירו את לביבות הזכוכית (cover slips) והעבירו את תמיסת הליזה למבחנה למיקרו-צנטריפוגה. לחלופין, בעת מיצוי RNA, העבירו כל הידרוג'ל לפלטה חדשה של שישה בארות והוסיפו 1 mL של triazole לכל בארה.

דגרו את הג'לים למשך שלוש דקות לאחר הדגירה. הסירו את תמיסת ה-triazole לאחסון במבחנה למיקרו-צנטריפוגה. שטיפה יסודית של לביבות הזכוכית (cover slips) לאחר הוספת A-P-T-M-S היא שלב חשוב ביצירת לביבות זכוכית ריאקטיביות.

לוחיות כיסוי שנשטפו ויבשו כראוי הן נקיות מכל שארית משקע. APTMS יגיב עם הגלוטראלדהיד ויייצר משקע עכור לבן. אם נוצר משקע, יש לחזור על הפרוצדורה כולה, כיוון שלוחית הכיסוי אינה שמישה יותר.

לאחר היווצרות ההידרוג'ל וציפויו בחלבוני ECM, זורעים את התאים למשך הלילה. קיים הבדל מובהק בין פריסת תאים על הידרוג'לים קשיחים לעומת רכים, כפי שניתן לראות בצביעת foid; תאי פיברובלסטים מעוברים של עכבר נפרסים במידה רבה יותר על הידרוג'לים קשיחים בהשוואה להידרוג'לים רכים. למעשה, מרבית התאים הנצמדים להידרוג'ל רך יישארו דחוסים וייצמדו בצורה פחות יעילה.

תוצאות PCR כמותיות מייצגות של רמות mRNA של cyclin D1 בפיברובלסטים עובריים של עכבר מראות כי cyclin D1 מוגבה באופן משמעותי על מטריצה קשיחה, אך לא על מטריצה רכה. הדבר מרמז כי קשיחות המטריצה מווסתת את התקדמות מחזור התא in vitro. הרגשנו להראות לכם כיצד לייצר הידרוג'ל בעל קשיחויות שונות, המדמה תנאים פיזיולוגיים in vivo. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להכין כיסויות תגובתיות נוספות, שכן תתרחשו תאונות וטעויות.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.