הערכת Dynamic תכונות רלוונטיים Immunologically מבנית השלישון של HIV-1 רצף V3 קראון Loop R2 על ידי מבראשית מתקפל
15 בספטמבר 2010
האזור כתר לולאה רצפים שונים V3 של גליקופרוטאין את פני השטח המעטפה (gp120) של HIV-1 יכול להיות מאופיין מבנית במקרים רבים על ידי קיפול ב סיליקו תפקידים 10-22 של הלולאה באמצעות המדינה-of-the-art מבראשית מתקפלים אלגוריתם. כאן אנו מדגימים את קיפול והערכה של האזור הזה של הלולאה V3 מהלחץ R2 של HIV-1, זן ייחודי נטרול רגיש עם תכונות תפקודית תמוה.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעריך את ההעדפות המבניות הדינמיות של רצף פפטיד ה-V three crown של זן R two של HIV באמצעות קיפול AR, ולהקריב את התוצאות עם רגישויות נטרול ידועות של זן R two. מטרה זו מושגת על ידי בחירת פרגמנט מתאים של לוליית ה-V three crown של R two לצורך קיפול AR bonni. כשלב שני, מבוצע סימולציה של הקיפול, אשר סורקת את כל הקונפורמציות האפשריות של פרגמנט ה-crown של R two ומתעדת את הקונפורמציות הסבירות ביותר בקובץ stack.
בשלב הבא, התצורות המוקלטות מנותחות כדי לקבוע את ההעדפה המבנית הדינמית של ה-R two V three crown שעשויה להסביר את הרגישות שלו לנייטרליזציה. התוצאות המתקבלות מעידות על העדפה למבנה בטא גמיש בעמדות 12 עד 14 של לולאת ה-V three, בהתבסס על מבנה שני, העדפה והתפלגות אנרגיה של קבוצת התצורות שנבדקו. שלום, אני טימותי קרדוזו, מדבר אליכם מהמעבדה שלי במחלקה לפארמקולוגיה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ניו יורק.
היום נציג בפניכם פרוצדורה לקיפול חלבון in vitro של לולאה גמישה בחלבון ויראלי של HIV-1 בעל פוטנציאל אימונוגני, הידוע כ-GP120. הלולאה הגמישה ידועה כלולאת V3 של גליקופרוטאין המעטפת השטחי הזה של נגיף ה-HIV-1, וקצבה ידוע ככתר של לולאת V3. זהו האזור אותו נקפל.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לסייע לנו לזהות מסלולים פוריים לעיצובים מוצלחים של חיסוני HIV. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, בחרו את רצף ה-V3 crown שיוקפל in silico.
מחקרים קודמים ממעבדה זו מצביעים על כך שמיקומים 10 עד 22 של כל רצף לולאת V three נותנים את התוצאות הטובות ביותר; הרצו את ניסויי הקיפול של armenio באמצעות תפריטי הבחירה הנוחים בממשק המשתמש הגרפי או ה-GUI של תוכנת המידול המולקולרי ICM Pro. ראשית, יש לבנות במרחב הווירטואלי של המחשב את המבנה האטומי התלת-ממדי של הפפטיד המקביל לרצף זה. כדי לבנות את המבנה האטומי התלת-ממדי, היכנסו לתפריט הקובץ (file) ובחרו ב"חדש" (new).
פעולה זו תחשוף מסך עם מספר לשוניות. בחרו בלשונית הפפטיד (peptide) והדביקו או הקלידו את הרצף בתיבת הטקסט. לחצו על אישור (okay) כדי לבנות את המבנה התלת-ממדי של הפפטיד.
המבנה יופיע בחלון הגרפי של ICM. לאחר בניית המבנה התלת-ממדי, עבורו לתפריט ה-molecular mechanics ובחר ב-minimize, שייפתח כתפריט צד. מתפריט הצד, בחר ב-global.
פעולה זו תציג מסך עם מספר שדות להזנה ותיבות סימון שנבחרו כבר לפי פרמטרי ברירת מחדל. במידת הצורך, שנו את הבחירה כדי לבחור את הפפטיד שיוכל קיפול. התאימו את אורך ודיוק הסימולציה על ידי שינוי מספר המהלכים הגלובליים (global moves) ומספר קריאות המינימום המקומי (local min calls), בהתאמה.
בחרו ב-Select all עבור קיפול של כל האטומים של הפפטיד. לאחר מכן, בחרו ב-save movie כדי ליצור קובץ סרט של הקיפול. לבסוף, לחצו על apply כדי להתחיל את הקיפול בחלון הגרפי.
האלגוריתם מתחיל לקפל את הפפטיד למבנים מרחביים שונים, תוך חישוב ותיעוד של אנרגיית הפפטיד עבור כל מבנה. עם סיום התהליך, המבנה היציב ביותר מבחינה אנרגטית של הפפטיד, כמו גם מבנים חלופיים בעלי אנרגיה דומה, יזוהו ויפוצגו באופן ויזואלי במחשב המבצע את קיפול הפפטיד. השימוש בממשק הגרפי מדגים כיצד נראה הקיפול, אך אינו מאפשר בחירה אופטימלית של פרמטרים עבור קיפול ה-V three loop crown.
לצורך כך, מומלץ לבצע את הקיפול משורת פקודה שאינה גרפית באמצעות סקריפט. סקריפט הוא פשוט סדרה של פקודות טקסט השמורות שורה אחר שורה במסמך או בקובץ טקסט, המוכנסות לתוכנת ה-ICM באופן אוטומטי ומוצאות זו אחר זו כדי לקפל את לולאת V3 באמצעות סקריפט של שורות פקודה. ראשית, כתבו קובץ טקסט שיישמר בכונן הקשיח של המחשב בספריה מקומית. כפי שנעשה בעבר, התחילו בבניית הפפטיד במרחב הווירטואלי של המחשב.
לאחר מכן תנו שם לסימולציה והגדירו את מספר המשתנים החופשיים, שהם הקשרי הכימיה בפפטיד שנותרו חופשיים לסבבב במהלך הקיפול. לאחר מכן, הגדירו את משך זמן הרצת הסימולציה עבור קיפול אופטימלי של לולאת V3. נתון זה יהיה תלוי במספר המשתנים החופשיים שזוהו בשלב הקודם; כדי לקבוע את דיוק החיפוש הקונפורמציונלי בניסוי, הגדירו את מספר צעדי החיפוש שיבוצעו בכל מינימום מקומי.
לאחר מכן, הגדירו פרמטרים נוספים שעברו אופטימיזציה עבור הסימולציה על בסיס מחקרים קודמים, כולל מינימום הטמפרטורה, הגרדיאנט והתפלגות ההסתברות. לאחר קביעת הפרמטרים הניסויים, ציינו אילו חישובי אנרגיה ישמשו במהלך הקיפול. כאן, האנרגיה של Vander Vi מצוינת על ידי VW internal peptide.
אנרגיה מסומנת על ידי 14, אנרגיית קשרי מימן מסומנת על ידי HB, אנרגיה אלקטרוסטטית מסומנת על ידי El, אנרגיית סולבציה מסומנת על ידי SF ואנטרופיה מסומנת על ידי EN. הגדירו את ההגדרות הסופיות, כולל זוויות השלד וזוויות הצד המועדפות לסריקה והקונופורמציה ההתחלתית.
לבסוף, כתבו את הפקודה להרצה ושמירה של החישוב. לאחר שהסקריפט נכתב ונשמר כקובץ טקסט, הרצו אותו דרך שורת הפקודה של מערכת ההפעלה של המחשב. כפי שנעשה בעבר, הקונפורמציה היציבה ביותר אנרגטית של הפפטיד, כמו גם קונפורמציות חלופיות בעלות אנרגיה דומה, יזוהו וישמרו בקובץ הפרויקט לצורך ויזואליזציה במחשב.
עם השלמת החישוב, פתחו את הקובץ על ידי בחירה ב-file open מתפריט ה-EE הנפתח. הציגו את המולקולה על ידי לחיצה על תיבת הסימון שלידה בלוח ה-workspace, ובחרו ב-molecular mechanics stack view. כדי לצפות בערימה המדורגת לפי אנרגיה של הקונפורמציות המובילות של הפפטיד מהקיפול, לחצו על כלי השרטוט (plotting tool) בפינה הימנית התחתונה של לוח הערימה כדי להציג את התוצאות.
ראשית לחצו על אישור בחלון שיופיע, ולאחר מכן לחצו על הלשונית האמצעית בגרף הנקראת best confo. לאחר מכן לחצו על השורה הראשונה בטבלת התוצאות המערכתית, שהיא הקונפורמציה בעלת האנרגיה הנמוכה ביותר שנמצאה בחיפוש. מבנה הפפטיד יסתדר מחדש לקונפורמציה בעלת האנרגיה הנמוכה ביותר בחלון הגרפי.
נתחו את הקונפורמציה הזו כדי לבחון מאפיינים דמויי גדיל בטא או סליל אלפא, במיוחד בחמש העמדות הראשונות של הפפטיד. בחרו אזור זה ברצף ולחצו על אייקון המקל (stick) בפינה השמאלית העליונה של המסך כדי להציג את כל האטומים. לאחר מכן, יש לנתח את ערימת תוצאות האנרגיה כדי להציג את הקונפורמציות הטובות ביותר.
אם הקונפורמציה בעלת האנרגיה הנמוכה ביותר מופרדת בפער משמעותי מהקונפורמציות האחרות, הדבר מעיד על נטייה למבנה קשיח. כדי להעריך את התוצאות, פתח את מבחנת הפרויקט ובחר ב-molecular mechanics stack view; תופיע טבלה של קונפורמציות הערימה (stack confirmations). ניתן להציג את קונפורמציות הערימה באופן ויזואלי על ידי לחיצה על סמל ההיסטוגרמה.
לבסוף, לחצו על כפתור הניגון של ערימת המכניקה המולקולרית (molecular mechanics stack play) כדי ליצור סרטon מהערימה ולהמחיש את העדפות הקונפורמציה שנחשפו במהלך הקיפול. התוצאות עבור קיפול R two מוצגות כאן. הקונפורמציה אינה אלפא-ספירלית אלא היא סליל אקראי (random coil), כפי שצפוי עבור לולאות V three, ובמיוחד במקטע בשאריות 12 עד 14.
בלולאה V three, נראה העדפת קונפורמציה ברורה של גדיל beta לאורך כל הערימה, ומעט מאוד קונפורמציות של סליל alpha נצפו. קונפורמציית גדיל beta מקומית מזוהה על ידי צורתה הליניארית המוארכת. זהו המיקום של רצף isoleucine proline methionine החריג של זן R two, רצף נדיר בזני HIV במיקום זה, אשר הועלתה השערה כי הוא האחראי למאפיינים החריגים של R two.
יתרה מכך, נראה פער אנרגטי של כמעט שלוש יחידות בין הקונפורמציה בעלת האנרגיה הנמוכה ביותר לבין הקונפורמציה השנייה בנמוכותה. לפיכך, המבנה חורג מהקונפורמציה בעלת האנרגיה הנמוכה ביותר בפחות מ-1% מהזמן, מה שמרמז כי לכתר R two V three ולקונפורמציית ה-beta strain המקומית שלו בעמדות 12 עד 14 יש מבנה קשיח יותר, במקום להיות גמיש לחלוטין מטבעו. הראינו לכם כיצד לקפל רצף לולאת כתר V three באמצעות אלגוריתם abio המיושם בתוכנת ICM, והראינו לכם כיצד לנתח את התוצאות באמצעות ה-R two strain של נגיף ה-HIV.
כדוגמה, בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לבחור בקפידה את זהות הפפטיד המתקפל התואם למקטע של ה-V three crown, וכן חשוב לפרש את התוצאות בנוגע להעדפה קונפורמציונית ולאנרגיה תוך התייעצות עם מומחה למידול מולקולרי. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מעריך את ההעדפות המבניות הדינמיות של רצף פפטיד הכתר V3 של זן R2 של HIV-1 באמצעות סימולציות קיפול מתקדמות. הממצאים שואפים להקריב העדפות מבניות אלו לרגישויות נטרול של הזן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה מבנית
- וירוסים
- ביולוגיה חישובית
רקע
- לולאת V3 של gp120 ב-HIV-1 היא קריטית להבנת הנטרול שלו.
- זן R2 של HIV-1 מראה רגישויות נטרול ייחודיות.
- טכניקות קיפול in silico יכולות לספק תובנות לגבי הדינמיקה המבנית של חלבונים ויראליים.
- הבנת דינמיקות אלה עשויה לסייע בתכנון חיסונים ובאסטרטגיות טיפוליות.
מטרת המחקר
- להעריך את ההעדפות המבניות של רצף הפפטיד של כתר ה-V3.
- להקרין את תוצאות הקיפול עם הרגישות לסמינוי של זן ה-R2.
- לזהות מאפיינים מבניים מרכזיים המשפיעים על התנהגות הנגיף.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בחירה של מקטע מהחלק העליון של לולאת R2 V3 עבור סימולציות קיפול.
- שימוש באלגוריתם קיפול ab initio לצורך ניתוח מבני.
- סימולציית קיפול לבדיקת קונפורמציות אפשריות.
- ניתוח של הקונפורמציות המתועדות כדי לקבוע העדפות מבניות דינמיות.
תוצאות עיקריות
- התוצאות מעידות על העדפה למבנה קשיח של גדיל בטא (beta strand) בעמדות 12 עד 14.
- נצפו העדפות למבנה שני על בסיס התפלגות האנרגיה.
- הממצאים עשויים להסביר את הרגישות לנטרול של זן R2.
- הנתונים תומכים בהשערה שדינמיקה מבנית משפיעה על נטרול ויראלי.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי המאפיינים המבניים של לולאת ה-V3 של זן R2.
- הבנת הדינמיקה הזו חיונית לפיתוח התערבויות יעילות נגד HIV-1.
- מחקרים עתידיים עשויים להתבסס על ממצאים אלו כדי לשפר אסטרטגיות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
הבנת העדפות המבנה הדינמיות של קודקודי הלולאה V3 ב-HIV-1 היא קריטית להפחתת סיכונים במועמדים למסע חיסון, על ידי קישור נוקשות קונפורמציונית לרגישות לסתירה (neutralization). גישה חישובית זו מאפשרת בחינה מבנית מהירה של זני נגיף מגוונים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובהפחתת סיכונים מנגנונית בשלבים מוקדמים של הגילוי. על ידי מתאם בין תוצאות הקיפול לפעילות אימונולוגית, השיטה מספקת ביטחון חיזוי בעיצוב אנטיגנים ותעדוף פורטפוליו לפיתוח חיסון ל-HIV.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי קישור רצף הלולאה V3 לדינמיקה מבנית ולזיהוי חיסוני.
- ערך תפעולי: מאפשר סריקה מהירה בשיטת in silico של אלפי זני HIV-1 במחזור הדם ללא מגבלות ניסיוניות.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות זיהוי מוטיבים מבניים שמורים בתוך שונות הרצפים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנת מודלים מבניים עשויים (validated) עבור מיפוי אפיתופים ובדיקות קישור של נוגדנים בשלבים הבאים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של אנליזה קונפורמציונית באמצעות פרוטוקולי קיפול ab initio הניתנים לשחזור.
- ערך מדעי: הפקת נתוני אנרגיה ומבנה שניוני כמותיים לצורך הערכה השוואתית של זנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר תובנות מבניות משלב הגילוי להערכה פרה-קלינית של השראה לנוגדנים ניטרליים רחבי ספקטרום.
- ערך תפעולי: מבטיח רצף מהמידול המחשוב אל בדיקות אימוגניות במודלים רלוונטיים של המחלה.
- ערך מדעי: תומך בקידום מותאם סיכונים באמצעות זיהוי מאפיינים מבניים הקשורים לרגישות ניטרול.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה ועד לאופטימיזציית המולקולות המובילות (lead optimization), ומאפשרת הפחתת סיכונים מבנית לפני תכנון האימונוגן.
- ביולוגיה של הגילוי: בוחן היפותזות על קשרי רצף-מבנה-תפקוד בחלבוני מעטפת ויראליים.
- סריקה: מספק אנסמבלים מבניים המוכנים לבדיקה עם העדפות קונפורמציוניות מכומתות.
- אנליטיקה: מספק מחסניות קונפורמציוניות מדורגות לפי אנרגיה והעדפות למבנה שני לצורך השוואה אובייקטיבית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין דינמיקה מבנית לבין פנוטיפים של נטרול שנצפו במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה חישובית הניתנת לשימוש חוזר להערכת גמישות אנטיגנית על פני יעדים ויראליים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באזורי לולאות גמישות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה של ניתוח מבני על פני רצפים ויראליים מגוונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go בבחירת אנטיגנים על ידי הבהרת הגורמים המבניים של פגיעות חיסונית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לוואקסון על בסיס מתאמים מבניים ואימונולוגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מבנית חישובית ובתוכנות למידול מולקולרי.
- תלוי בגישה לאלגוריתמים של קיפול ab initio ובמשאבים חישוביים מספיקים לדגימה קונפורמציונית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין קבוצות המידול, האימונולוגיה ותכנון החוואכונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפרוטוקול על מערכות לולאות ויראליות שונות או מטרות חלבון שונות.
- כולל מגבלות מעשיות כגון דיוק שדות הכוח (force field) והשלמות של הדגימה באזורים גמישים במיוחד.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
1:07
Introduction
4:19
R2 HIV-1 Strain V3 Loop ab initio Folding via the ICM-Pro Command Line
1:57
R2 HIV-1 Strain V3 Loop ab initio Folding via the ICM-Pro GUI
6:35
ab initio Folding Data Analysis
8:41
Representative Results for R2 HIV-1 Strain V3 Loop ab initio Folding
9:59
Conclusion
