Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות תרופות חדשות המודולות ערוצי grk. דבר זה מושג תחילה על ידי זריעת תאי A TT 20 בתוך פלטה של 96 בארות. השלב השני הוא דילול תרכובות הבדיקה באמצעות מערכת Verset לטיפול בפלטות נוזלים.

בשלב הבא, מתיקים את התרכובות הנבדקות המדוללות על התאים באמצעות ה-verset. השלב הסופי הוא להכניס את פלטת 96 הבארות לקורא הפלטות הפלואורסצנטי Synergy two, ולהזריק לבארות את תמיסות הביקורת ואת תמיסות הסומטוסטטין. לבסוף, נעשה שימוש בקורא הפלטות הפלואורסצנטי כדי להציג את התרכובות המשנות את האות הפלואורסצנטי המושרה על ידי סומטוסטטין, ובכך מווסתות את תעלולי ה-Grk.

היתרון של הליך זה על פני שיטות קיימות, כגון רישום patch clamp, הוא שניתן לסנן במהירות מספר רב של תרכובות כדי לקבוע אם הן מווסתות ערוצי gerk. ההשלכות של טכניקה זוי לומדות לכיוון של טיפול בכאב, כיוון שניתן לזהות תרכובות המפעילות את ערוץ ה-Gerk, אשר מובילות לעיכוב של תמסורת nociceptive ב-FI. מדגימה את הליך הציפוי של פלטות 96 בארות וזריעת התאים היא Maribel Vasquez.

סטודנט במעבדה שלי יתחיל את ההליך על ידי גידול תאי היפופיזה AT T 20 ב-DMEM מועשר ב-10% horse serum בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה עם 5% CO2. יש לתחזק את התרבית על ידי תת-תרבית (subculturing) של התאים מדי חמישה עד שבעה ימים תוך שימוש בפרוצדורת סטנדרטיזציה. לאחר מכן, יש לצפות את הבארות של הלוח השחור השקוף.

פלטה של 96 בארות עם 50 µL של poly L lysine בתחתית. יש להניח לבארות להתייבש במשך 30 דקות באינקובטור. לאחר מכן, יש להסיר את עודפי ה-poly L lysine ולזרוע את התאים בפלטת 96 הבארות המכילה 200 µL של מצע גידול בצפיפות של 30,000 תאים לבער.

לאחר מכן, אחסנו את התאים באינקובטור למשך שלושה עד ארבעה ימים. השתמשו במערכת שאיבה כדי לשאוב באיטיות את מצע הגידול משכבת התאים החד-שכבתית (monolayer), ולאחר מכן שטפו את התאים עם 200 µL של תמיסת בופר רגילה. לאחר מכן, הוסיפו לכל אחד 200 µL של תמיסת בופר המכילה צבע הרגיש לפוטנציאל הממברנה.

דגרו את התאים למשך 40 דקות ב-37 °C. לאחר 40 דקות, הוציאו את תאי ה-A TT 20 מהאינקובטור והמתינו שיחזרו לטמפרטורת החדר, ושאבו את הבופר הישן. לאחר מכן, הוסיפו לתאים תמיסת בופר טרייה המכילה MPD.

בשלב הבא, השתמשו במערכת לטיפול בנוזלים כדי להוסיף ריכוזים שונים של תרכובות הבדיקה ותמיסות ביקורת לתאים. בלוחית 96 הבארות, דגרו את התאים במשך חמש דקות עם תרכובות הבדיקה לצורך המדידות הפלואורסצנטיות. בהליך זה, הכניסו את לוחית 96 הבארות לקורא לוחות פלואורסצנטי מסוג biotech synergy two.

מדדו את אות הרקע הפלואורסצנטי באורך גל עירור של 520 nanometers ובאורך גל פליטה של 560 nanometers. לאחר מכן, החילו את הליגנדים של G PCR R או את תמיסת הביקורת לבארות כדי להפעיל את תעלות ה-GIR באמצעות מערכת ההזרקה Synergy two. לאחר מכן, אספו את נקודות הנתונים במרווחי זמן של עשר שניות לאורך תקופת דגימה של 302 שניות.

בארכי העגור של העירור והפליטה. חשבו את מקדם Z כדי לקבוע את מהימנות הבדיקה. מקדמי Z בטווח של 0.5 עד 1.0 מעידים על כך שאיכות הבדיקה מצוינת.

פלטות עם ערכי Z factor נמוכים מ-0.5 מוחרגות. מהניתוח, תרכובות המווסתות את האות הפלואורסצנטי נבדקות שוב בנוכחות 2 mM של barium chloride או 500 nM של terapin Q כדי לאשר ספציפיות לתעלות אשלגן מסוג inward rectifier; מוצג כאן אות פלואורסצנטי מייצג של HLB 0 2 1 1 15 2 שנמדד לאורך זמן בתאי A TT 20 עם הוספה של somatostatin או תמיסת ביקורת. היחס של עוצמת הפלואורסצנציה בציר ה-Y חושב על ידי חלוקת האות בנוכחות somatostatin או תמיסת הביקורת באות הבסיס שנמדד לפני הוספת ה-somatostatin או תמיסת הביקורת.

המוצג כאן הוא הטיפול בתאי A TT 20 באמצעות 500 nM של Terapin Q, המעכב את הירידה באות הפלואורסצנטי המתווכת על ידי סומטוסטטין דרך קישור וחסימה של ערוצי G. ומוצג כאן הטיפול בתאי A TT 20 באמצעות 20 µM של propafenone, שגם הוא מעכב את הירידה באות הפלואורסצנטי המתווכת על ידי סומטוסטטין. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשעתיים, במידה והיא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות תרופות המודולות ערוצי grk באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי.