עכברים Transnuclear עם מוגדרים מראש תא קולטן T ספציפיות נגד Toxoplasma gondii לקבל ע"י SCNT

עכברים טרנסגניים עם קולטני T ספציפיים לאנטיגן היו חיוניים בחקר הפיתוח והתפקוד של תאי T, כדי ליצור מודלים של עכברים עם ספציפיות מוגדרת מראש של קולטני T באמצעות העברה גרעינית של תאי סומטיים או SCNT. עכבר מודבק בפתוגן הרלוונטי. תאי T מבודלים מהעכבר ולאחר מכן מטוהרים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS).

תאי ה-T המזוהים משמשים לאחר מכן להעברה גרעינית של תאים סומטיים. לאחר שהעוברים מגיעים לשלב הבלסטוציסט, מבודלים תאי גזע עובריים. תאים אלה מוזרקים לאחר מכן לתוך בלסטוציסטים, אשר מועברים לאחר מכן לעכברים בהריון דמה.

הגורים המתקבלים מראים עלייה מובהקת באוכלוסיית תאי ה-T הרלוונטית, אותה ניתן לתקף באמצעות ניתוח PAX. שלום, שמי Okta AK ואני פוסט-דוקטורטית כאן במכון White למחקר ביו-רפואי. היום אני אראה לכם כיצד לבצע הזרקות סיוע בבלאסטוציסטות להעברה של CLE סומטית, וכן העברה של עוברים.

היתרון המרכזי של העברה סומטית הוא שניתן ליצור מודלים של עכברים המבטאים את הקולטן של תאי ה-T שלהם מהלוקוס האנדוגני, ולכן תחת בקרה של הפרומוטר האנדוגני, וכן שניתן ליצור מודלים של עכברים במהירות רבה. העברה סומטית נוזלית יכולה לשמש ככלי ליצירת מודלים של עכברים עם סגוליות מוגדרות מראש של קולטני תאי T או קולטני תאי B. דבר זה בעל עניין מיוחד עבור חוקרים הפועלים בתחומים כגון אוטואימוניות, מחלות זיהומיות וסרטן.

כדי לבודד תאי T ספציפיים לפתוגן כגון Toxoplasma gondii, עכבר שהודבק באמצעות הזרקה תוך-פריטונאלית בשיאו של התגובה החיסונית, הטחול מבודל מהעכבר לאחר קטילתו, ותאי תורם הומוגניזים מבודלים לאחר מכן ומודגרים עם נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית ועם הטטראמר המתאים. לבסוף, מבוצע מיון תאים (FACS) כדי להשיג תאי T ספציפיים לפתוגן. בערב שלפני הליך הוצאת הגרעין מהביצית.

הכינו מחטי הזרקה של piso בקטרים של ארבעה, חמישה ושבעה מיקרומטר, והשתמשו במזרק כדי להטעין אותן בכיריקה בשיטת טעינה רטרוגרדית. למחרת, התחילו בפרוטוקול להעברה גרעינית של תאי סומטיקה על ידי איסוף ציטות, ולאחר מכן, באמצעות פיפטה פואלית, העבירו אותן לטיפות של תמיסת K-S-O-M-A-A בתוך צלחת פטרי. במכסה של צלחת הפטרי.

הכינו פלטה לביצוע העברה גרעינית של תאי גוף (somatic cell nuclear transfer) או SCNT על ידי הנחת כ-10 טיפות של PVP, כ-10 טיפות של HCZB המכיל 5 µg/mL של cyto B וכ-10 טיפות של HCCB המכיל 2.5 µg/mL של cyto B. פלטה זו תיקרא פלטת S-C-N-T-A. הניחו את פלטת ה-S-C-N-T-A על הבמה של מיקרוסקופ אור פוך.

שב כעת מחט להוצאת גרעין (enucleation needle) בקוטר שבעה מיקרומטר אל תוך המיקרו-מניפולטור ושטוף אותה על ידי שאיבה של תמיסת PVP להשלכה 5 עד 10 פעמים. לאחר מכן, העבר 10 עד 30 ציטים שעוצרו בשלב מטאפאזה II מתוך צלחת הפטרי לאחת מהטיפות של HCCB עם 5 µg/mL Cyto B על גבי פלטת ה-S-C-N-T-A. הדגר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר; במהלך ההדגרה, יישר את הציטים באופן אופקי.

לאחר חלוף חמש דקות, השתמש במחט האנוקלואציה (enucleation needle) כדי להניח אוציט לפני מחט ההחזקה. באמצעות מיקרו-מזרק, הפעל ואקום כדי לקבע את האוציט למחט ההחזקה של המיקרו-פיפט.

בשלב הבא, באמצעות מחט הדי-נוקלאציה, סובב את התבצית עד שהקומפלקס של כישורי הכרומוזומים, הנראה שקוף יותר בהשוואה לציטופלזמה, נמצא במצב השעה שלוש, והפעל פולס פיזו על ידי לחיצה על הדוושה כדי לחדור את ה-zona lucida. פולס פיזו הוא פולס מכני הנע לאורכה ומרטט את קצה מחט הדי-נוקלאציה. הרטטים של הקצה מסייעים בקידוח דרך ה-zona lucida.

לאחר החדירה דרך ה-zona pellucida, מקמו את פתח מחט הגרעין בסמיכות לשפולה של המטפאזה השנייה והפעילו את הוואקום. קומפלקס הכרומוזומים והשפולה יזוזו באיטיות לתוך המחט. לאחר הוצאת המחט, הממברנה אמורה להיסגר מעצמה.

לבסוף, בעזרת פיפט פה, העבירו את התאים שעברו גרעין חזרה אל טיפות ה-K-S-O-M-A-A. לאחר מכן, באמצעות אותו פיפט, שטפו אותם על ידי העברתם מטיפה לטיפה של KSOM AA. כדי לבצע העברה גרעינית, החליפו את מחט ההסרת-גרעין בקוטר 7 מיקרומטר על המיקרו-מניפולטור במחט להעברה גרעינית בקוטר 4 עד 5 מיקרומטר. שטפו את המחט בעזרת PVP כפי שנעשה קודם לכן.

העבירו את שמונה תאי ה-T החיוביים ל-CD שבודדו קודם לכן לתוך טיפה של PVP על לוח ה-S-C-N-D-A. ערבבו היטב והדגירו לפחות 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו 10 עד 30 תאים ENUCLEATED לתוך טיפה של HCZB בריכוז 2.5 micrograms per milliliter.

דגו את תאי ה-Cyto B על פלטת S ct. הכניסו לדגירה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, השתמשו במחט להעברת גרעין כדי ליישר את התאים בצורה אופקית באמצעות מחט ההזרקה.

שאבו תא תורם CD8 positive מתוך מדיום ה-PVP והעבירו אותו פנימה והחוצה עד לפירוק הממברנה החיצונית. במידת הצורך, הפעילו פולס פיזואי (pizo pulse); שברים של הממברנה והציטוזול אמורים להיות גלויים. שאבו את הגרעין לתוך המחט.

לאחר מכן, המשיכו לאסוף גרעינים עד למספר של 10 עד 30. כעת, עברו לטיפה המכילה את התאים המנוקלאים המסודרים. הפעילו את הוואקום כדי לקבע אווציט אחד למחט ההחזקה.

לאחר מכן, מקמו את מחט ההעברה הגרעינית (NU) בסמוך ל-zop lucita, כאשר הגרעינים מכוונים הרחק מהפתח. השלימו פולסי pizo עד שהמחט תחדור דרך ה-zop lucita. דחפו את המיקרו-מניפולטור כדי להעביר בזהירות גרעין אחד לקצה המחט.

דחפו את המחט אל תוך התבצית עד ששני שלישים מקצה המחט נמצאים בפנים. הפילו לחץ שלילי קטן כך שחלק קטן מקרום התבצית יישאב אל תוך המחט. השלב הבא הוא קריטי ביותר.

מאחר שזהו הזמן היחיד שבו התבצית פתוחה למעשה. החילו פולס ZO בודד. לאחר מכן, הפילו לחץ חיובי כדי לדחוף את הגרעין החוצה מהמחט.

משכו את המחט בזהירות לאחור כך שהקצה יהיה בערך בשליש דרכו אל תוך האוציט, ולאחר מכן הפעילו לחץ שלילי והמשיכו למשוך את המחט לאחור כדי לאטום את האוציט. חזרו על שלב זה עם כל אוציט.

לאחר שכל תאי הביצית (oocytes) קיבלו גרעין, העבירו אותם לצלח פטרי ושטפו אותם על ידי העברה מטיפה לטיפה של מצע KS OM AA שעבר דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 30 דקות. לאחר הדגירה, העבירו את עוברי ה-SCNT לטיפות של מצע אקטיבציה נטול סידן המכיל strontium chloride. ה-strontium chloride מפעיל את תא הביצית על ידי השראה של תנודות הסידן שמתרחשות באופן דומה במהלך ההפריה.

דגרו במשך שש שעות. במידה ורוצים, הוסיפו TSA, המהווה מעכב לא ספציפי של היסטון דה-אצטילאז, למצע ההפעלה. כדי לשפר את היעילות לאחר ההפעלה, בחנו את העוברים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לקבוע את כמות הפסאודו-גרעינים (pseudo pronuclei) או עוברי SCNT חיוביים ל-PPN. ניתן לזהות את ה-PPN על סמך המראה שלהם.

הם נראים כמו ביצים. שטיפה ותרבית במצב "עין עם חלבון למעלה". העוברים וטיפות K-S-O-M-A-A למשך שלושה וחצי ימים ב-37 degrees Celsius עד שהם יגיעו לשלב הבלסטוציסט.

בתחילה, עליכם להתמקד בביצוע נכון של הפרוצדורות שהראינו acabr להגרמה עבור גרעין ו-NU nuclear transfer. ברגע שתשלטו בטכניקות אלו, יהיה קל יותר לנהל את הפרוצדורות הבאות. תאי הגזע העובריים או תאי ה-ES שנעשה בהם שימוש כאן הופקו באמצעות טכניקות סטנדרטיות.

יש להכין אלו ביום ההזרקה בסיוע פיצוץ (blast assisted injection), שלושה וחצי ימים לאחר ההזבקה. הכינו את המכסה של צלחת חיידקים סטרילית על ידי מריחת טיפות המכילות PVP ו-HCZP. לאחר מכן, הכינו מחט הזרקה של 15 מיקרומטר עבור פולס הפיקו (piso pulse) כפי שנעשה בעבר.

בשלב הבא, מקמו את מחט ההזרקה במיקרו-מניפולטור ושטפו אותה באמצעות העברה של PVP. בצעו בין 10 ל-30 פעימות סיוע (blasts) לתוך טיפה של HCZB. לאחר מכן, העבירו בין 5 ל-50 µL של תרחיף ה-ESL לתוך טיפה אחרת של HCZB.

יש להשתמש בכמות מספקת של תאי ES כך שניתן יהיה לאסוף אותם בקלות, אך יש להימנע מצפיפות. לאחר מכן, אספו בין 30 ל-100 תאי ES באמצעות מחט ההזרקה. עברו לטיפה עם ה-blast assist.

יישרו את מחזיק הבלסטוציסט (blast assist) בצורה אופקית וקבעו אחד באמצעות מחט התמיכה על ידי הפעלת ואקום. השתמשו במחט ההזרקה כדי לסובב את מחזיק הבלסטוציסט עד שהמסה התאית הפנימית (inner cell mass) נמצאת בשעה תשע. מקמו את מחט ההזרקה בשעה שלוש.

וודאו שאין תאי ES בקצה המחט, והפעילו פולס פיזו עד שמחט ההזרקה חודרת דרך ה-zop lucita וה-trifecta אל תוך ה-blastic seal. שחררו בין חמישה ל-15 תאי ES כך שיידבקו למסה התאית הפנימית. המשיכו עד שכל ה-blast assist יוזרקו. לאחר סיום ההזרקות.

שטפו פעמיים ב-K-S-O-M-A-A והמשיכו להעברה כירורגית של העוברים אל תוך נקבות בהריון מדומה. הניחו עכברה רקבה בהריון מדומה ומורדמת באזור הניתוח. בעזרת מכשיר גילוח חשמלי, הסירו את הפרווה מהרבע הימני התחתון. חטאו את האזור באמצעות תמיסה מבוססת יוד ו-70% ethanol תחת מיקרוסקופ סטריאו.

השתמשו במספריים כדי לפתוח את העור, ולאחר מכן הניחו מספריים סגורים בין העור לבין הפריטונאום ופתחו אותם כדי להפריד את הפריטונאום מהעור. אתרו את השחלה דרך הפריטונאום, שהיא אמורה להיראות כנקודה אדומה. לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לפתוח את הפריטונאום באזור זה.

השתמשו בפינצטה כדי לתפוס בזהירות את ה-UCT או את השומן שסביבו, ומשכו החוצה את הרחם באמצעות קפילריה המחוברת לפפיפטה ידנית. אספו קבוצה של כ-10 בלאסטוציסטים תוך כדי החזקת חלבוק הביצה והרחם בפינצטה. השתמשו במחט כדי ליצור חור קטן ברחם.

לאחר מכן, הכניסו את הנימה עם הבלסטוציסט אל תוך חלל הרחם ושחררו אותם. החזירו את הרחם אל חלל הבטן. אתרו את קצוות הצפק וסגרו אותו באמצעות מספר תפריים.

סגרו את עור העכבר באמצעות מספר סיכות. ניתן תרופות לשיכוך כאבים תת-עורית. לאחר מכן, העבירו את העכבר בחזרה לכלובו תחת מנורת חימום.

יש לעקוב אחר נשימת העכבר עד להתעוררותו. לאחר ביצוע גרעין העין (enucleation) והעברה של גרעין תא סומטי. כ-70% מהעוברים היו חיוביים לגרעיני דמי-פרונוקליאוס (pseudo pronuclei).

כפי שמוצג בדמות זו. טיפול ב-TSA למשך שש או 10 שעות לא השפיע. לאחר שלושה וחצי ימים בתרבית, 5% עד 10% מהעוברי התפתחו לשלב הבלסטוציסט.

שוב, להוספת TSA לא הייתה השפעה על קצב התפתחות הבלסטוציסטים. הבלסטוציסטים שהופקו ב-SCNT שימשו לאחר מכן להפקת תאי גזע עובריים. TSA שיפר באופן משמעותי את הקצב שבו הופקו ESL מהבלסטוציסטים.

תאי S-C-N-T-E-S משמשים ליצירת עכברים כימריים. דם נשאב מעכברים אלו ונבדק לנוכחות של תאי T ספציפיים באמצעות ניתוח FACS כפי שמוצג כאן. כאשר הדם נצבע עם נוגדן anti CDA וטטראמר ספציפי, ניתן לזהות אוכלוסייה כפולה חיובית.

דבר זה מעיד כי התא התורם ששימש ל-SCNT היה בעל הסגוליות הנכונה. הרגשתי לכם כעת כיצד לבצע העברה של תאי סומטיים, הזרקות סיוע בבלאסטוציסט והעברת עוברים. הנקודה החשובה ביותר שיש לקחת בחשבון היא טהרת תאי ה-T או תאי ה-B שלכם.

לאחר שלמדת כיצד לבצע העברה סומטית והעוברים שלך הגיעו לשלב הבלסטוציסט, תוכל לבחור בין העברתם ישירות לנקבות בהריון מדומם, לבין שימוש בהם להפקת תאי גזע עובריים וליצירת עכברים כימריים.