קביעת מספר נייד במהלך תרבית תאים באמצעות מונה Cell שרביט השלטון

סופר התאים scepter הוא מכשיר אוטומטי נייד לספירת תאים, ניטור קוטר ונפח התאים, ובדיקת הבריאות והאיכות של אוכלוסיות תאיות. הוא מציע יתרונות משמעותיים על פני שיטות ספירה אחרות, כולל דיוק משופר, קלות שימוש ועלות נמוכה לספירת תאים. בעת השימוש ב-scepter, יש לעקוב אחר ההוראות המופיעות על התצוגה הגרפית שלו כדי לשאוב את התאים אל החיישן החד-פעמי.

לאחר מכן סופרים את התאים והמכשיר מדווח על ריכוזי התאים ועל נתונים סטטיסטיים, אותם ניתן להעלות למחשב ולנתח. שלום, אני סוניה. אני מדענית מחקר כאן ב-Millport, והיום אראה לכם כיצד להשתמש ב-scepter.

ספירת תאים היא שלב הכרחי אך מייגע בתרביות תאים in vitro. ריכוזים עקביים של תאים מבטיחים הדירות ודיוק ניסיוניים. ספירת תאים חשובה לניטור בריאות התאים וקצב השכפול, להערכת תאים אלמוותיים או שעברו טרנספורמציה, לזריעת תאים עבור ניסויים עוקבים, לטרנספקציה או להדבקה, ולהכנה לבדיקות מבוססות תאים, וכל זאת תוך צורך במהירות ובדיוק.

בספירת תאים, 71% מתוך 400 חוקרים שנסקרו סופרים תאים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer). למרות שהמוציטומטריה היא זולה, היא רשומית ומסועבת וחשופה להטיות משתמש ולשימוש שגוי, מה שמוביל לספירות לא מדויקות. מקורות השגיאה בהמוציטומטריה כוללים פיזור תאים לא אחיד בדגימה, או מספר רב או מועט מדי של תאים בדגימה.

החלטות סובייקטיביות לגבי השאלה האם תא מסוים נמצא בתוך אזור הספירה המוגדר. זיהום של ההמו-ציטומטר, שונות בין משתמשים ושונות בקצב מילוי ההמו-ציטומטר כדי להקל על השעמום הקשור לספירה ידנית. 29% מהחוקרים סופרים תאים באמצעות מכשירים אוטומטיים לספירת תאים.

עם זאת, עבור רוב החוקרים, המחיר הנלווה למכשירים גדולים אלו המונחים על שולחן המעבדה מהווה מחסום לשימוש בהם. סופר התאים Scepter הוא מכשיר ידני אוטומטי המציע את האוטומציה והדיוק של ספירת Coulter בעלות נמוכה יחסית ובפורמט ידני קל לשימוש. המערכת מיישמת את עיקרון ה-Coulter לגילוי חלקיקים המבוסס על עכבה (impedance) בפורמט ממוזער, תוך שימוש בשילוב של חומרה אנלוגית ודיגיטלית לעיבוד אותי חישוש, אחסון נתונים ותצוגה גרפית.

החיישן החד-פעמי תוכנן עם אזור חישוב תאים המיוצר במיקרו-פבריקציה, המאפשר הבחנה לפי גודל תא ונפח תא ברזולוציה של סאב-מיקרון וסאב-פיקוליטר, עם שיפור באמצעות ערוצי טיפול בנוזלים ואלקטרוניקה מדויקים. מונה התאים scepter מציג גרפית את הסטטיסטיקה של אוכלוסיית התאים כהיסטוגרמה לשימוש. תהליך הספירה במונה התאים scepter מתחיל בדילול של תליה של תאים בודדים בתוך phosphate buffered saline.

ריכוז של 10,000 עד 500,000 תאים למיליליטר הוא האופטימלי. העבירו 100 µL של תאים מדוללים לשפפור microview בנפח 1.5 מיליליטר. הדליקו את סופר התאים scepter על ידי לחיצה ממושכת על המתג בגב המכשיר והמתינו להופעת ההוראות על המסך.

כאשר תתבקש, חבר חיישן לקצה יחידת ה-scepter, כאשר פאנל חישוף האלקטרודות פונה לכיוון חזית המכשיר. חיישני scepter מורכבים מתא דגימה המיוצר בדיוק גבוה, עם אזור חישוף אלקטרוני ואלקטרודות חישוף תאים מובנות. החיישנים מאפשרים להבחין בין גדלי תאים ברזולוציה סוב-מיקרונית ובין נפחי תאים ברזולוציה סוב-פיקוליטרית.

הנדסת חיישנים עקבית מבטיחה שסכמי דגימות שווים ייספרו ומדידות גודל מדויקות יבוצעו. לאחר חיבור החיישן, בצע כל שלב בתהליך הספירה בהתאם להוראות המופיעות על המסך באופן הבא. כאשר על המסך יופיע "החזק את הבוכנה כדי להתחיל" (hold down the plunger to begin), לחץ על הבוכנה; לאחר מכן יופיע על המסך "טבול את החיישן" (submerge the sensor), טבול את החיישן לתוך תמיסת תרחיף התאים, ושחרר את הבוכנה כדי לשאוב את תרחיף התאים אל תוך החיישן.

הבוכנה משמשת כאות חשמלי ותשאב את הדגימה בתוספת הנפח המת בתוך החיישן. מהירות או דיוק הלחיצה אינם משפיעים, בניגוד למה שקורה בעת פיפטור. תהליך זה יימשך מספר שניות כאשר הוא יהיה מוכן.

המכשיר ישמיע צליל וההודעה "sample loaded" תוצג על המסך. ברגע שהדגימה נטענת אל החיישן, היא נמשכת דרך אזור החשיפה להערכת גודל התא ונפח התא. לאחר מכן, דרך המיקרו-ערוצים, ברגע שנספרות 50 µL של דגימה, החיישן מאותת למכשיר להפסיק את הספירה.

לאחר השלמת הספירה, על מסך המכשיר תופיע ההודעה count complete. אנא הוציאו את החיישן והשליכו אותו. פעלו לפי ההנחיה, הוציאו והשליכו את החיישן.

המכשיר יציג לאחר מכן על מסכו היסטוגרמה של גודל התאים או קוטרם, וכן את ריכוז התאים למיליליטר. לאחר השלמת הספירה והצגת ההיסטוגרמה במכשיר, יש להחיל שערים (gates) על ידי לחיצה על כפתור הבחירה, ולבחור ב-auto gating או ב-use last כדי לקבוע את השער באופן אוטומטי על סמך פרופיל ההיסטוגרמה או להשתמש בשערים מהספירה הקודמת. ללא קשר לבחירה, ניתן להזיז את השערים ידנית לצורך כיוונון עדין.

כוון את הנתונים, לחץ שוב על כפתור הבחירה (toggle) כדי לבחור את השער השמאלי והזז את כפתור הבחירה כדי להזיז את השער כרצונך. לאחר מכן, לחץ שוב על כפתור הבחירה כדי להפעיל את השער הימני והזז את כפתור הבחירה כדי למקם את השער הימני. לחץ שוב.

יוצגו ריכוז תאים חדש, נפח תא ממוצע וקוטר. ניתן להשתמש במתג כדי להחליף את התצוגה בין התאריך והשעה, גודל התא הממוצע ונפח התא הממוצע; ניתן לשמור עד 72 היסטוגרמות במכשיר עצמו. כדי להעלות את הנתונים למחשב אישי, חברו את המכשיר דרך יציאת כבל ה-USB, וסימני הנתונים יופיעו על מסך התצוגה במחשב.

לחצו לחיצה כפולה על אפליקציית התוכנה scepter כדי להפעיל אותה. לאחר מכן, לחצו על connect. כל הספירות יועברו באופן אוטומטי לתוכנה.

תוכנת היישום scepter מציגה את ההיסטוגרמה המפרטת את התפלגות האוכלוסייה של התרבית לפי נפח או קוטר. ניתן לייצא את הקבצים שהורדו ל-Microsoft Excel, שם יוצגו הנתונים הגולמיים בקטגוריות (bins) של קוטרי תאים או נפחי תאים מוגדרים. 19 קווי תאים שונים הוכנו לספירה, וריכוזי התחלה תיאורטיים נקבעו באמצעות מונה תאים.

תלsuspensions של תאים אלו דוללו לאחר מכן כדי לקבל תלsuspensions של תאים בריכוזי תאים תאורטיים. לאחר מכן נעשה שימוש במספר תאים מסוג scepter כדי לקבוע את ריכוזי התאים. איור זה מציג חמשה דילולים שנמדדו עבור חמישה קווי תאים מייצגים, לצד ריכוז התאים התאורטי.

המידה הגבוהה של הלינאריות, כפי שמעידים ערכי ה-r-squared, מוכיחה כי ספירה באמצעות scepter היא שיטה מהימנה עבור שורות התאים שנבדקו בטווח פעולה לינארי רחב. הדיוק היחסי הכולל של ספירת scepter מוצג כאן, כאשר נתונים שהתקבלו מספירת scepter מושווים לספירות שהתקבלו מספירת coter. הלוגריתם של ספירות התאים ב-scepter מוצג אל מול הלוגריתם של ספירות ה-coter, ומראה כי בכל שורות התאים שנבדקו, ספירות ה-scepter תואמות לספירות ה-coter.

ספירה של 19 קווי תאים בוצעה באמצעות מונה תאים Z two coulter. ספירת תאים באמצעות scepter, מונה אוטומטי מבוסס ראייה, כגון מערכת V cell או count test, וספירת hemo TER בוצעו על פי הוראות היצרן תוך שימוש באותה סספנסיית תאים התחלתית ובדילולים זהים. התוצאות המוצגות בדמות זו מדגימות כי ריכוזי התאים שנמדדו באמצעות ספירת scepter תואמים באופן הדוק לריכוזי התאים התאורטיים עם ליניאריות גבוהה.

מקדם השונות באחוזים (CV) חושב עבור כל דילול של כל סוג תא. עבור כל אחת ממערכות הספירה המוצגות כאן, מופיעים מקדמי השונות הממוצעים באחוזים על פני 19 סוגי תאים, ביחס לריכוז התאים ולשיטת הספירה בתוך טווח העבודה. מונה התאים Scepter מדויק יותר מספירה באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer), ומציג סטיות תקן קטנות יותר ומקדמי שונות ממוצעים קטנים יותר.

ספירה באמצעות Scepter מהירה פי 10 מאשר ציטומטריית דם ומהירה יותר גם ממספרי תאים אוטומטיים אחרים. כאן נספרו תאי SF nine, MCF seven ו-HC 2 93 באמצעות השיטות המתוארות בסרטון זה. נרשם הזמן הממוצע שנדרש למדידת ריכוז התאים.

שימו לב כי ספירת תאי דם בוצעה פעם אחת בלבד לכל דגימה. מכשיר ה-Scepter מבצע מדידות המבוססות על גודל התאים. לפיכך, ניתן לזהות כל שינוי במורפולוגיה התאית בהיסטוגרמה.

תרביות בריאות מציגות התפלגות גאוסיאנית יפה בצורת פעמון, בעוד שתאים לא בריאים מתים וגורמים להסטה של ההיסטוגרמה שמאלה. באופן דומה, כאשר אוכלוסייה של 50% תאים מתים עורבבה עם 50% תאים חיים, נצפו גם הן הסטות בהיסטוגרמה. הרגשתי להראות לכם כיצד להשתמש במונה התאים Scepter החדש של Millipore, אשר מחולל מהפכה בדרך שבה חוקרים סופרים את התאים שלהם.