כימותים אוטומטיים וניתוח הליכי ספירה הניידת באמצעות תוספי ImageJ

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשתמש בכלי ניתוח דיגיטליים כדי לבצע במהירות ספירה מדויקת של תאים בתרחיף או בנדידה בקרום בדיקת פלישה. פרוטוקול זה יכול לעזור לחוקרים לכמת את מספר התאים הנדרש לטכניקות נפוצות ולבדיקות תנועתיות תאים במבחנה. היתרון העיקרי של שיטה זו, הוא שהיא מספקת ספירת תאים מהירה ומדויקת תוך הכללת מספר מסננים וכלי ניתוח.

כדי להתחיל, הגדר את תאורת המיקרוסקופ למקסימום. עבור למטרה 4x וודא שמסנני ניגודיות הפאזה נמצאים בשימוש. לאחר מכן, בתוך תוכנת המיקרוסקופ, הגדר את הגדרות לכידת התמונה לערכי ברירת המחדל שלהן.

כעת הנח המוציטומטר סטנדרטי על שלב המיקרוסקופ וצלם תמונה לשלב כיול נפח התמונה. התאם את זמן החשיפה לפי הצורך. ב-ImageJ, תחת מחשבון ריכוז התאים, פתח את התמונה ולחץ על קבל ממד תמונה לחצן.

פעולה זו ממלאת את תיבות המלל של הרוחב והגובה של התמונה ברזולוציית התמונה בפיקסלים. לאחר מכן, בחר בכלי הקו הישר וצייר קו ישר לכל אורך ריבוע ה-p הראשי של המוציטומטר על ידי לחיצה וגרירה של הסמן. לאחר מכן, לחץ על מקש M כדי להציג את חלון התוצאות.

כעת, הקלד את הערך מעמודת האורך לתוך תיבת הטקסט באורך ריבוע p במחשבון ריכוז התאים. לאחר מכן, לחץ על כפתור חשב נפח תמונה כדי להוציא את נפח התמונה לתיבת הטקסט של נפח התמונה. לבסוף, לחץ על להציל כפתור להשלמת כיול התוסף.

לניתוח דגימה, טען 10 מיקרוליטר של תאים לשני התאים של שקופית המוציטומטר והתאם את המיקוד כך שפנים התאים יהיה כהה יותר מקרום התא כדי לספק מיקוד בתוך החתך המרכזי של התא ולא בקטבים. לאחר מכן, התאם עוד יותר את החשיפה כך שהתאים לא ייחשפו יתר על המידה. קווי המוציטומטר גלויים מעט מקובלים.

כעת, צלם חמש עד עשר תמונות לא חופפות של האזור המרכזי של ההמוציטומטר. הרזולוציה וההגדלה של כל תמונה חייבות להיות זהות לאלה שהיו עבור תמונת כיול עוצמת הקול. לאחר מכן, במחשבון ריכוז התאים, לחץ על ספירת תאים ובחלון המוקפץ, בחר תיקיה לספירה.

לאחר מכן, בתיבת קלט המספר לדוגמה, הזן את מספר התמונות שצולמו בכל תא ולחץ על אישור. התוסף יאסוף כעת את הנתונים. ראה את הטקסט לפרטים נוספים. כדי להתחיל, בתוך תוכנת המיקרוסקופ, הגדר את הגדרות לכידת התמונה לערכי ברירת המחדל שלהן.

לשלב היקף הניתוח, השתמש ברקע לבן מוצק והשתמש במקור אור מעל הבמה, רצוי שתי נורות LED גמישות. כעת, הנח שקופית ממברנה לבדיקת הגירה שהושלמה על הבמה. בהסתכלות על התמונה בזמן אמת המוצגת על ידי התוכנה, התאם ידנית את ההגדלה כך שהקצוות של ממברנה בודדת יהיו ממש בתוך שדה הראייה של המצלמה.

לאחר מכן, התאם את מיקומי מקור האור וזמני החשיפה כדי לשחזר, קרוב ככל האפשר, את התמונה האידיאלית. בעל צבע רקע מינימלי וממברנה מוארת באופן אחיד. הדיוק של ספירת התאים תלוי ברכישת תמונה באיכות גבוהה.

לכן חשוב לצלם את התמונה הטובה ביותר שניתן להשיג על ידי מצלמת המשתמש לשימוש היעיל ביותר בתוספים. כעת, הסר את השקופית ואיזון לבן את התמונה בתוכנת המיקרוסקופ כדי להשלים את הכיול. מיד לפני ההדמיה, יש לשטח כל קרום על ידי הפעלת לחץ על החלקת הכיסוי כדי להסיר כמה שיותר בועות כלואות.

כעת, בתוך התוכנה, הגדר את מיקום תיקיית הלכידה. לאחר מכן, צלם תמונה אחת לכל ממברנה, ושמור את קבצי התמונה כ-TIF באמצעות מוסכמת השמות של דגימה 001 עם הגדלות מצטברות למספר עבור כל תמונה. מוסכמת מתן שמות זו נדרשת כדי שהתוסף ימצא את הקבצים.

אם יש צורך בתיקון שדה שטוח, עבור כל שקופית מצא אזור ריק וצלם תמונה ריקה. שמור את הקובץ כשם לדוגמה ריק. לאחר מכן, ב-ImageJ, פתח את התוסף TC.

בתוך TC, לחץ על כפתור Flatfield, ומתיבת הדו-שיח בחר ספרייה בחר את התיקיה בה נשמרו תמונות הממברנה. כעת, פתח תמונת ממברנה של בדיקת הגירה ובחר סף צבע. בחלון, הגדר את השיטה ל-Shanbhag.

הגדר את צבע הסף ללבן. הגדר את מרחב הצבעים ל-RGB ובטל את הסימון של אפשרות הרקע הכהה. לאחר מכן, כוונן את המחוונים העליונים לאפס ואת המחוונים התחתונים ל-255 כדי להפוך את התמונה ללבנה לחלוטין.

לאחר הלבן, התאימו את המחוונים הירוקים והאדומים עד שרק הגרעינים נראים לעין. בתוסף TC, העתק את הערכים של מחווני RGB לתיבות הטקסט המשויכות של סף RGB של הגדרות התצורה. לאחר מכן, לחץ על הוסף/שנה כפתור והחלף את התצורה.

בחלונית הגדרות התצורה, לחץ על שמור כדי לכתוב את ההגדרות בכונן הקשיח. כעת, כדי לספור את התמונות עם תוסף TC, לחץ על תיקיית ספירה ובחר את התיקיה לספירה. לאחר מכן התוכנית תעבד את התמונות ותוסיף אוטומטית את הנתונים לטבלה הראשית.

כעת, בטבלה הראשית, יופיע סימן ביקורת בכיול? העמודה אם בתמונה מסומנת לכיול על סמך הדמיון שלה למדדים האידיאליים. בחר את כל הדגימות המסומנות לכיול.

לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר ספירה חוזרת וגודל מוצע. זה יספר מחדש את התמונות עם שטח החלקיקים המינימלי המוצע. לאחר מכן, לחץ שוב באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר הצג עלילה.

לתמונה אידיאלית יהיה גרף הדומה להתפלגות נורמלית ארוכה עם זנב ימני. במידת הצורך, התאם את טווח הגודל התחתון או את הגדרות סף ה-RGB על-ידי בחירת הדגימה, לחיצה ימנית ובחירה ב-Recount and Manual Settings. לאחר מכן, הזן את ההגדרות הרצויות ולחץ על ספירה כדי לספור מחדש את התמונה.

כדי להתאים את הספירה באופן ידני, בחר את הדגימות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הטבלה ובחר פתח תמונה עם ספירות. התמונה המקורית תיפתח בסימנים אדומים המייצגים כל חלקיק שנספר על ידי התוסף. בנוסף, ניתן להשתמש באפשרות הצג תמונה בינארית שנספרה כדי לבדוק עד כמה תאים בודדים נפתרים על ידי סף הצבע.

כדי להוסיף ספירה באופן ידני, החזק את מקש Control לחוץ ולחץ לחיצה שמאלית. זה יוסיף סמן במיקום הסמן שמתווסף לספירה הכוללת. כדי להסיר סמן באופן ידני, לחץ לחיצה ימנית על התמונה והתוסף יסיר את הסמן הקרוב ביותר לסמן.

להסרת קבוצת סמנים, בחר אזור עניין ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על האזור תוך כדי לחיצה ממושכת על מקש הבקרה. התהליך של מחשבון ריכוז התאים תלוי בתמונת הכיול של ריבוע p ובחישוב אורך ופיקסלים בריבוע p. לריבוע p של המוציטומטר יש נפח של 100 ננו-ליטר, ובהתחשב בקבוע זה, ניתן לחשב את נפח התמונה הכולל לאחר המרת פיקסלים למילימטרים.

השוואה של ספירה ידנית ואוטומטית על פני 57 תמונות מניסויים וסוגי תאים שונים, מראה שיש מתאם הדוק מאוד בין שתי השיטות. ריכוזים בין חמישה מיליון ל-2,000 תאים למיליליטר נספרו במדויק באמצעות התהליך האוטומטי. המדד Q מייצג את בהירות התמונות הכוללת על סמך התפלגות גדלי החלקיקים השונים.

Q הולם גדול מ-0.5. ביישום מזהים אלה על מבחר תמונות צנועות עד מצוינות בכל הנוגע לבהירות ורעשי רקע, ספירות התמונות המכוילות היו קרובות משמעותית לספירות ידניות מאשר ספירות תמונות לא מכוילות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לספור בצורה מדויקת ויעילה תאים בתרחיף ומבדיקות תנועתיות תאים באמצעות תוספי CCC ו-TC ImageJ.

לאחר שליטה בתוסף TC, בו ניתן לבצע רכישה, כימות והתאמה של ספירת תאים תוך פחות משעה. שני התוספים מסתמכים על תכונת ספירת החלקיקים מ-ImageJ וניתן לשנות אותם על ידי עריכת פקודות המאקרו המשמשות את ImageJ. זה מציע גמישות רבה יותר למשתמש להרחיב את היקף התוספים לחלקיקים אחרים.