שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לשלב דגימה של תוצרת טרייה באמצעות סרט דביק עם זיהוי מולקולרי של תאים שלמים של מיני salmonella, תוך שימוש בשיטת היברידיזציה פלואורסצנטית מהירה ב-C two, המכונה גם fish. הדבר מתבצע תחילה על ידי הצמדת סרט דביק לחומר הרצוי ושליפת תאים הקשורים לפני השטח. ניתן לנתח את הסרטים הטעונים בתאים באופן ישיר או להעבים אותם להעשרה בפאזה מוצקה או נוזלית.

השלב השני של הפרוצדורה הוא קיבוע עצמי על סרט ודהידרציה בסדרה של אתנול עבור תאים שהוכנסו לתוך ציר או הועשרו בו. השלב השני כולל קיבוע תאים בסספנסיה, ולאחריו רסוספנסיה של התאים בבופר אחסון. השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע שלב היברידיזציה מהיר על סרט באמצעות תערובת פרובים של אוליגונוקלאוטידים ספציפיים לסלמונלה, ולאחריו הסרת עודפי פרוב באמצעות שטיפה בבופר שטיפה; עבור דגימות המנותחות באמצעות fax, שלב ה-fish מבוצע בסספנסיה, וניתן להסיר עודפי פרוב באמצעות שלב דילול פשוט לפני הניתוח.

השלב הסופי של הפרוצדורה הוא צביעה נגדית של התאים הקשורים לסרט ההכלה המגובב באמצעות DPI ובחינתם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה. עבור ניתוחים מבוססי עובדות, אין צורך בצביעה נגדית. בסופו של דבר, שיטה זו מספקת אמצעי לזיהוי חזותי או ציטומטרי של מיני salmonella שעשויים להיות נוכחים בתוצרת טרייה שנדגמה.

הרעיון לשיטה זו עלה בראשי לראשונה כאשר קראתי על קבוצה איטלקית שהשתמשה בגישה דומה לבחינת קהילות חיידקים על שרידי אבני אוויר רומיות. לאחר מכן, אני ו-r הובלנו דיון על עבודה זו בשיעור שהעברתי על שיטות מהירות במיקרוביולוגיה של מזון. מספר שבועות לאחר מכן, פרצה מגפת סלמונלה שהקשירה את מקור הזיהום לתוצרת טרייה, ובסופו של דבר גרמה למחלה לכמעט 1500 אנשים ב-43 מדינות שונות.

בעוד שהגישה הניסויית שלנו מציעה נתיב יעיל ומעשי לזיהוי סוגים ספציפיים של חיידקים בתוצרת טרייה, היא גם ניידת מספיק כדי לאפשר בדיקה בשטח או בסביבת ייצור מזון. התחילו בבחירת סרט דבק לשימוש עבור הדגימה. חלק מהאפשרויות כוללות סרטי דבק לפטריות הזמינים מסחרית או סרטי接触 (contacted) שהם סטריליים וארוזים לנוחות השימוש.

באמצעות טוש קבוע, שרטטו ריבועים של סנטימטר אחד על הצד שאינו דביק של חתיכת סרט דבק באורך 10 סנטימטר, בעזרת תבנית אלומיניום סטרילית. אלו ישמשו כמדריך חזותי לרישום של איזה חלק מהסרט שימש לדגימה של המזון או של משטח הסביבה. צרו לולאה של הסרט בצורת C, כאשר הצד הדביק פונה אל המשטח המיועד לדגימה. כדי לעשות זאת, החזיקו את הקצוות הדביקים בעזרת האגודל והאצבע האמצעית, והניחו את האצבע המורה על הריבוע ששורטט בגב הסרט.

הניחו את הסרט על פני השטח שמהם יש לדגום, והדביקו בעדינות את האזור המסומן אל פני השטח מבלי לשחרר את קצות הסרט. השתמשו באצבע המורה כדי להבטיח שהצד הדביק של הסרט יבוא במגע מלא עם פני השטח של הדגימה. הימנעו מהיווצרות בועות באמצעות תנועה אחידה.

הסר את הסרט לאט מהדגימה. שליפה פיזית של מיקרובים הקשורים לפני השטח מקבעת את מטען התאים. הדבק את הסרט בצדו הדביק כלפי מעלה על גבי זכוכית של מיקרוסקופ. בעת שימוש בסרט משרדי שקוף רגיל, ודא כי קיים מתיחה ומתיחות נאותים של הסרט כך שייווצר משטח שטוח ללא קמטים.

פעולה זו תסייע לצמצם בעיות של דפורמציה או התקמטות של הסרט במהלך החימום העוקב. במהלך ההיברידיזציה, הניחו את הסרט עם הפנים כלפי מטה על לוחות agri מסוג xylose slicing tertile four או XLT four, כך שהתאים שנדגמו יהיו במגע ישיר עם שטח פני ה-agri, כדי להקל על הסרת הסרט ממשטח ה-agri.

בעקבות ההעשרה, חלק מגע הדגימה התבניתית של הסרט מונח בצמוד לפני השטח של ה-agri, וקצה אחד של הסרט מודבק באופן רפוי. דפנות צלוחיות הפטרי מפוכות כדי למנוע התעבות ומדגירות בטמפרטורה של 35 °C. כדי לאפשר צמיחה מספקת של מיני salmonella, אורך תקופת ההדגירה הדרושה להעשרת התאים לרמה שניתן לזהות תלויה ברמות זיהום ה-salmonella הראשוניות.

לאחר תקופת ההעשרה הרצויה, פתחו את פלטת האגר; הסרט ישמור על דביקותו במהלך הדגירה. לחצו בעדינות את הסרט אל האגר באמצעות האצבע המורה כדי להבטיח השחזה מרבית של מיקרו-מושבות שנוצרו בממשק שבין הסרט לאגר, אחזו בסרט מהקצה המחובר לדופן של פטרי הדגירה והסירו אותו בתנועה איטית ואחידה. בעזרת סרט הדבקה שקוף רגיל, הצמידו את סרט טעינת התאים כאשר הצד הדביק פונה כלפי מעלה על גבי זכוכית מיקרוסקופ, כך שייווצר משטח שטוח ללא קמטوط.

בצע קיבוע תאים על הסרט למשך 30 דקות ב-25 degrees Celsius על ידי כיסוי אזור מגע הדגימה ב-500 µL של פורמלין בנייטרלי 10%. השלך את המקבע למכל סגור תחת מנדף כימי כדי למזער חשיפה לאדים המגירים או הרעילים, ושטוף את הסרט פעם אחת ב-1x phosphate buffered saline או PBS על ידי הצפה עדינה של פני הסרט ב-PBS כדי להוציא את המים מהדגימה. באמצעות סדרה פרוגרסיבית של אתנול, הכן בופרים לפני היברידיזציה, היברידיזציה ושטיפה תוך שימוש בתמיסות מסחריות בדרגת ביולוגיה מולקולרית, סנן באמצעות מזרק עם פילטר של 0.22 µm וחמם מראש את בופרי ההיברידיזציה והשטיפה ל-55 degrees Celsius.

הוסיפו פרובים של אוליגו-נוקלאוטידים המסומנים פלואורסצנטית לתמיסור היברידיזציה שחומם מראש, כך שריכוז הפרובים הסופי יהיה 5 ng/µL. כסו את אזור המגע של הדגימה על הסרט ב-300 µL של תמיסור היברידיזציה המכיל את תערובת הפרובים, והדגירו את התאים הקשורים לסרט המהוברים בתא דגירה לח אוטם המכוון ל-55 °C, באמצעות אינקובטור במגע ישיר, כגון מכשיר במצב שקופיות (slide mode), למשך 15 דקות. לאחר ההיברידיזציה, יש להוציא את השקופיות ולהסיר את שכבת תמיסור ההיברידיזציה המכילה את הפרובים. שטפו קצרה ובעדינות עם תמיסור שטיפה שחומם מראש באמצעות פיפטור.

נפח קטן של בופר על גבי זכוכית נושאת מוטה מאפשר לייבוש של הזכוכית באוויר לצורך זיהוי של מיני salmonella באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כסו את הזכוכית ב-10 µL בערך של Vector Shield H 1200, תוך שימוש במצע הרכבה המכיל dpi, הצבע הנגדי של הגרעין, והדגירה בחשכה למשך 10 דקות. הניחו שמן טבילה על מכסי הזכוכית ובחנו את הדגימות באמצעות עדשת שמן בהגדלה גבוהה.

מסנן ה-DPI משמש להבאת הדגימה למוקד. לאחר מכן, המיקרוסקופ מועבר למסנן המתאים, ותאי salmonella נספרים באופן חזותי לפי הפלואורסצנציה הירוקה או האדומה שלהם, בהתאם לצבע ששימש לסימון הגששים. לצורך זיהוי ציטומטרי, העבירו דגימות תלויות ב-PBS למבחנות דגימה בעלות תחתית עגולה של 5 ml ובחנו אותן באמצעות ציטומטר זרימה עם עירור ב-647 nanometers.

נתחו את הנתונים באמצעות תוכנת FlowJo. דגימה באמצעות סרט דבק של terica serovar, Ty Murium מפני השטח של עגבנייה שזוהמה באופן מלאכותי, מקלה על ניתוח ישיר לאחר הדגימה באמצעות מיקרוסקופיה או טעינת תאים לציטומטריה של זרימה. הסרטים עובדו לפלואורסצנציה מהירה ב-C two hybridization באמצעות שילוב של גששים של DNA ספציפיים ל-salmonella שסומנו ב-Texas Red, בהתאם לריכוז המקומי הראשוני של תאי salmonella על הסרט.

העשרה במוצק הניבה תוצאות שנעו בין מיקרו-מושבות מבודדות לצמיחה קונפלואנטית. ניתן היה לנתח תאים שנדגמו באמצעות סרט באמצעות שילוב של FISH וציטומטריית זרימה, מיד לאחר הדגימה או בעקבות חמש שעות של שטח פנים נוזלי. העשרה בתרבית מיני ב-35 °C.

למרות שתיארנו את השימוש בטכניקת דגי הדבק (tape fish) לבטיחות מזון, לשיטה זו יש גם פוטנציאל גבוה לשימוש בדיסציפלינות אחרות, כולל מיקרוביולוגיה סביבתית, פתולוגיה של צמחים או מיקרוביולוגיה קלינית. במקביל להליך זה, ניתן לבצע ניסויים נוספים, כגון בדיקות ביוכימיות או PCR, על העשירותים בשלב מוצק או נוזלי מהדגימות שהופקו באמצעות הדבק. ניתן להשתמש בבדיקות אלו כדי לענות על שאלות הנוגעות ל-salmonella שעשויה להיות נוכחת, שאלות שחורגות מהיקף הפרוצדורה של הדגים.