גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות ולהגדיר חיידקים באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי שחרור ה-ribosomal RNA מהחיידקים כדי לאפשר היברידיזציה עם פרובה הגילוי המפולורת; כשלב שני, ה-ribosomal RNA הקשור לפרובת הגילוי מוסף לאלקטרודת העבודה, מה שמאפשר היברידיזציה עם פרובת הלכידה על פני השטח של החיישן. לאחר מכן, מאפשרים לצמיג anti fluorescein horse radish peroxidase להיקשר לפרובת הגילוי המפולורת.

לבסוף, ניתן לקבל זרם אינטרפרומטרי, שעוצמתו נמצאת במתאם עם מספר קומפלקסים של גששי לכידה ריבוסומליים וגששי זיהוי RNA על פני השטח של החיישן. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות מבוססות תרבית הוא שניתן לזהות ולהבחין בחיידקים תוך כ-45 דקות, ובכך נמנעת ההמתנה למשך הלילה עבור חיידק שצריך ליצור מושבה נראית לעין על פלטת EDGAR. יישום של טכניקה זו ישפר את הניהול של מחלות זיהומיות.

מאחר וגילוי מוקדם של פתוגנים בקטריאליים חיוני לטיפול אנטיביוטי ממוקד ולשיפור התוצאות הקליניות. למרות ששיטה זו שימושית לאבחון מחלות זיהומיות, ניתן להחילה אותה גם על בעיות אבחון אחרות, כגון אבחון אימונולוגי. התחילו בהדגרה של Probe הלכידה המדולל עם hexane di thiol למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להבטיח שקבוצת התיאול ב-Probe הלכידה תהיה במצב חסר, מה שיוביל לתוצאות עקביות יותר.

לאחר הדגירה, הפעל זרם של חנקן על שבבי מערך החיישנים בעלי ציפוי זהב למשך חמש שניות כדי להסיר לחות או חלקיקים. יש להחיל בזהירות נפחים קטנים של נוזל על האלקטרודה העובדת במערך החיישנים. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית.

ביצוע נכון של טכניקות הפיפטינג, השטיפה והייבוש מפחית משמעותית את השונות בין השבבים. כעת, יש להנחית 6 µL של תערובת גשמי הלכידה המדוללים של ה-HDT על האלקטרודה העובדת של כל 16 החיישנים במערך החיישנים, ולאחסן את שבבי החיישנים בצלחת פטרי מכוסה בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה. למחרת, יש לשטוף את שבבי החיישנים במים דה-יוניים למשך שתיים עד שלוש שניות, ולאחר מכן לייבש את השבבים תחת זרם חנקן למשך חמש שניות. כעת יש להנחית 6 µL של תמיסת attri hydrochloride sodium chloride, EDTA MERCAPTOETHANOL על האלקטרודה העובדת של כל 16 החיישנים, ולדגור את החיישנים למשך 50 דקות בצלחת פטרי בטמפרטורת החדר.

להכנת הדגימות לבדיקת החיישן האלקטרוכימי: העבירו מיליליטר אחד של תרבית חיידקים בשלב הצמיחה הלוגריתמי למבחנת מיקרו-צנטריפוגה, ולאחר מכן סובבו את התאים בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-16,000 gs. שימו לב כי יש לטפל בחיידקים פתוגניים תחת מנדף בטיחות ביולוגית.

לאחר הסרת ה-snat, העבירו באמצעות טיפ של פיפט 10 µL של נתרן הידרוקסיד בריכוז של 1 M לתחתית מבחנת המיקרו-צנטריפוגה, ובצעו פיפטו up and down מספר פעמים כדי לסבב את המשקע באופן יסודי. לאחר דגירה של התושה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, הוסיפו 50 µL של PBS המכיל bovine serum albumin או BSA וגשש זיהוי modified fluorescein כדי לנטרל את הליסאט החיידקי. לאחר מכן, דגרו את הליסאט המנוטרל למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

התחילו את השלב הזה על ידי שטיפת תמיסת המרקפטואתנול מאחד משבבי החיישן שהוכנו במים דה-יוניים למשך שתי עד שלוש שניות. לאחר ייבוש השבב כפי שהודגם כעת, יש להניח ארבעה µL של ליזאט החיידקים המנוטרל על האלקטרודות העובדות. 14 מהחיישנים.

לאחר מכן, גרף ארבעה µL של האוליגונוקלאיד המגשר לתוך התמיסה של PBS פלוס BSA פלוס גשש זיהוי משופר פלואורסצאין על שני חיישני ביקורת החיוביים. לאחר דגירה של הליזאט וחיישני ביקורת החיוביים במשך 15 דקות, שטוף ואייבש את שבב החיישנים כולו כפי שנעשה קודם לכן. כעת, גרף ארבעה µL של נוגדן אנטי-פלואורסצאין פרוקסידאז עםד (HRP) ב-PBS המכיל קזאין על האלקטרודות הפעילות של כל 16 החיישנים.

לאחר דגירה של 15 דקות, יש לשטוף ולייבש את שבב החיישן. לאחר מכן, יש להדביק מדבקת סרט (film well sticker) על פני השטח של שבב החיישן ולהניח את השבב למקום בתושבת שבב החיישן. יש להעביר בעזרת פיפט 50 µL של תסבס TMB לכל 16 החיישנים ולסגור את תושבת שבב החיישן. לבסוף, השתמשו בקורא שבבים מסוג Helios כדי לקבל מדידות pyrometry ו-cyclic telemetry עבור כל 16 החיישנים.

הבדיקה האלקטרוכימית שתוארה כעת בנויה באופן דומה ל-ELISA מסוג סנדוויץ', כפי שמוצג באיור זה; היברידיזציה של RNA ריבוזומלי מטרה עם פרובים ללכידה וגילוי מפותחת על ידי תגובה רדוקס המזורזת על ידי HRP המצומד לפרגמנטים של נוגדן אנטי-פלואורסצאין, הנקשרים לקישור של תרי-פין פלואורסצאין שעל פרוב הגילוי. מרכיב חשוב ברגישות הבדיקה הוא הכימיה של פני השטח של אלקטרודת הזהב. אלקטרודת הזהב מצופה במרקפטואתנול ובביוטין, והיא מפונקציונלית על ידי הוספה של פרובי לכידה מהוללים.

היברידיזציית סנדוויץ' של ה-ribosomal RNA של המטרה עם פרוב הלכידה ועם פרוב הגילוי המסומן ב-fluorescein יוצרת קומפלקס המזוהה על ידי הוספת נוגדן anti fluorescein בצמידות ל-horse radish peroxidase, ומצע TMB. הזרם הפרמטרי M נוצר על ידי מחזור חמצון-חיזור הנובע מחמצון ה-TMB על ידי horse radish peroxidase וחיזור ה-TMB על ידי אלקטרונים מהאלקטרודה. הבדיקות המוצגות כאן משתמשות בשבב מערך חיישנים מסוג gene fluidic 16.

כל אחד מהחיישנים במערך מכיל שלוש אלקטרודות - עבודה, ייחוס ועזר - להן נקודות מגע בקצה השבב. לקורא השבבים יש פיני pogo המתחברים לכל אחת מנקודות המגע. קורא השבבים משמש כממשק עבור מערך החיישנים עם פוטנציומטר הנשלט על ידי אלגוריתם מחשב.

כאן מוצגות דוגמאות לזרימת זרם בחיישן אלקטרוכימי. זרימת הזרם בחיישנים היא גבוהה באופן מלאכותי במהלך השניות הראשונות לאחר תחילת המדידות הפרמטריות. בשל הצטברות של תסס מחומצן במהלך הזמן שחל מההחלה של TMB על פני השטח של החיישן ועד להפעלת אלגוריתם הקריאה, זרימת הזרם מגיעה במהירות למצב יציב, וניתן לקבל קריאות מדויקות של החיישן באופן מהימן בתוך 60 שניות.

השונות בין חיישן לחיישן היא קבועה יחסית, כך שניתן לבצע 16 בדיקות חיישנים שונות במקביל על גבי שבב מערך החיישנים gene fluidic 16. בקרות חיוביות ושליליות הן חיוניות; כבקרת חיובית, נעשה שימוש באוליגנוקלאיד DNA מגשר סינתטי, המהibridizes הן לפרוbes הלכידה והן לפרוbes הגילוי ומשמש כמטרה סינתטית בריכוז ידוע. התוצאות המתקבלות באמצעות האוליגנוקלאיד המגשר משמשות כבקרת כיול פנימית כדי למזער את השונות בין שבב לשבב.

ככל שהזרם השלילי של האלקטרודה גדול יותר, כך האות גבוה יותר. בעת בדיקת גששים של לכידה וגילוי, יש לקבוע את גבול הגילוי באמצעות דילול סדרתי של דגימה בריכוז ידוע; כפי שמוצג באיור זה, קיים מתאם לוגריתמי-לוגריתמי ליניארי בין ריכוז הדגימה לבין האות הפלט לאורך הטווח הדינמי של הבדיקה.

בגרפים של עמודות אלה מוצגות תוצאות מייצגות עבור דגימות המכילות Escherichia coli, Klebsiella ו-ammonia, הנמצאים לעיתים קרובות בשתן של מטופלים עם זיהום בדרכי השתן; האותים עבור רוב החיישנים יהיו נמוכים ודומים, וניתן לאחד תוצאות שליליות אלו כסיגנל רקע. התגובתיות עם זוג הגששים של KE מבדילה בין C. canonical ל-E. coli. האוליגונוקלאיד המגשר משמש כביקורת חיובית וכסטנדרט כיול פנימי. ניתן ליישם טכניקה זו לזיהוי חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה בדגימות קליניות, באמצעות מדידת התגובה הפנוטיפית של החיידקים לאנטיביוטיקה.

ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקבוע את הטיפול האופטימלי עבור מטופל בודד. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות ולבחין בין חיידקים על ידי השוואת זרמי המטריקה (atric currents) בחיישנים השונים הספציפיים לממינים שבשבב.