המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים את הקלות שבה ניתן לבצע Western blot בעת שימוש במוצרים מתאימים. לאחר הכנת הדגימות, החלבונים מופרדים על בסיס גודלם ומועברים לאחר מכן לשלב מוצק. לאחר מכן, החלבונים נסרקים באמצעות נוגדנים ומזוהים; שימוש בפרוטוקולים נכונים ובריאגנטים איכותיים וכלכליים מבטיח תוצאות משופרות של western blotting.

שלום, אני ג'סי לוהאן, מדען מחקר ופיתוח ב-EMD Chemicals בסן דייגו, קליפורניה. EMD היא חברה בת של Merck, KGAA בדארמשטט, גרמניה. היום נראה לכם הליך של western blotting.

אם כך, נתחיל. השלב הראשון ב-western blotting הוא הכנת הדגימה. התחילו את הכנת הדגימה על ידי שקיעת התאים באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה, כגון חמש דקות ב-2,500 ×g.

לאחר הצנטריפוגציה, רוקנו את משקעי התאים. השעיקו היטב את התאים בריאגנט להפקת חלבונים מסוג cyto buster, תוך שימוש ב-150 µL ל-10⁶ תאים. דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

בשלב הבא, סובב את הדגימה במשך חמש דקות ב-16,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לאחר הצנטריפוגה. העבר את ה-SNA המרוקח למבחנה נקייה והמשך בניתוח. לאחר הערכת ריכוז החלבון בדגימה, הכן את הדגימה לטעינה אל הג'ל כדי לדנטור את החלבון.

השתמשו בבופר דגימה המכיל דטרגנט דנטורציה אניוני כגון sodium dodecyl sulfate או SDS. הרתיחו את התערובת בטמפרטורה של 95 עד 100 °C למשך חמש דקות. באמצעות ג'ל יצוק (precast gel) זמין מסחרית, ניתן להפריד חלבונים במהירות על בסיס משקל מולקולרי.

מלאו את יחידת האלקטרופורזה בתמיסת ריצה (running buffer), שניתן להכין מרכיבים המוצעים בקו הכימיים של Omni PU. טענו לבאר בנתיב הראשון את סמן החלבון trail mix. לסמן זה יש שלושה פסי ייחוס המאפשרים ניטור במהלך האלקטרופורזה.

לאחר צביעת הג'ל, נראים 10 פסים, הנעים בין 10 ל-225 kilo Daltons. טענו את הדגימה הדנטורית לבארות שנותרו. הריצו את הג'ל במתח של 220 volts למשך שעה אחת.

לאחר הפרדת החלבונים, צבע את הג'ל ב-kumasi blue כדי לוודא שהחלבונים נדדו באופן שווה ואחיד באמצעות צבע מהיר וצבע אולטרה-רגיש, שמוכן לשימוש ללא DS. הצביעה נחוצה כיוון שחלבונים בעלי מטען חשמלי יכולים להיות מונחים לנוע דרך ג'ל בשדה חשמלי, כך שניתן להעביר את החלבונים בשדה חשמלי מהג'ל אל ממбраנה כגון NITROCELLULOSE או PVDF. בעת שימוש בממברנות PVDF, השרה את הממбраנה במתנול למשך מספר דקות, ולאחר מכן בצע הרגלה בבופר העברה קר במי קרח למשך חמש דקות. השרה גם את הג'ל למשך מספר דקות בבופר העברה קר במי קרח; הרגלה זו מונעת התכווצות של הג'ל במהלך ההעברה.

עבור העברה רטובה, הרכיבו "סנדוויץ'" של הג'ל והממברנה בין ספוג לנייר. לאחר מכן, הדקו את המבנה יחד בחוזקה, לאחר שווידאתם שלא נוצרו בועות אוויר בין הג'ל לממברנה. טבלו את הסנדוויץ' במבuffer העברה והפעילו שדה חשמלי.

החלבונים בעלי המטען השלילי ינועו לעבר האלקטרודה בעלת המטען החיובי. לאחר מכן, הממברנה תעצור אותם, תקשור אותם ותמנע מהם להמשיך הלאה. עם השלמת ההעברה, יש לבצע ויזואליזציה של החלבונים כדי לוודא שההעברה הייתה אחידה וללא בועות אוויר.

ניתן לבצע זאת בקלות באמצעות צבע red alert ל-Western blot. צבע זה מוכן לשימוש וניתן להסיר אותו בקלות בעזרת מים. זהו הג'ל לאחר הסרת הצבע על ידי שטיפה במים, לפני שניתן יהיה לזהות את הממברנה באמצעות נוגדן; הממברנה נחסמת.

כדי למנוע קישור לא ספציפי, חסמו את הממברנה באמצעות ריאגנטים חסמיים באיכות גבוהה. כדי למנוע רקע מוגבר, הדגירו אותה בתמיסת חסימה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תחת ערבוב עדין, ולאחר ההדגרה שטפו את הממברנה שלוש פעמים ב-TBST או PBST. ניתן להכין באקלות ובנוחות באפרים אלו באמצעות טבליות TBS tween וטבליות PBS tween, בהתאמה.

לאחר חסימת הממברנה ושטיפתה, ניתן להדגיר אותה עם הנוגדן הראשוני. יש להשתמש בנוגדן הראשוני בתמיסה אחת של signal boost, המאפשרת הגברה משמעותית של האות. הכין את הנוגדן הראשוני בתמיסה אחת והדגר את הממברנה למשך שעה אחת.

אין צורך להוסיף חומרי חסימה נוספים לאחר האינקובציה. שטפו את הממברנה ב-TBST. לאחר מכן, דגרו את הממברנה עם הנוגדן המשני, המדולל בתמיסה שתיים של signal boost, למשך שעה אחת.

לבסוף, שטפו שוב את הממברנה מספר פעמים עם TBST עבור הצמדת HRP. לזיהוי נוגדנים משניים נעשה כאן באופן מסורתי שימוש בפליט אור כימי מוגבר או ECL. נעשה שימוש בערכה המהירה של ECL, שכן היא אינה דורשת ערבוב של לומינול או של מחזק (enhancer).

יש להרסס את הממברנה מספר פעמים, להדגיר למשך שתי דקות, ולפתח אותה באמצעות סרט רנטגן. Rapid Step מספק רגישות נמוכה לסדר גודל של פיקוגרמים, וכן פליטה חלשה למשך עד שעתיים לאחר הוספת הסובסטרט. סממני חלבון מסוג Trail mix מאפשרים מעקב אחר חלבונים במהלך אלקטרופורזה בהשוואה לפרוטוקולים סטנדרטיים של Western blot.

הגברת אות (Signal Boost) מאפשרת טווח דינמי ורגישות גבוהים יותר. לבסוף, ניתן להשיג רגישות מעולה על ידי שימוש בשלב מהיר (Rapid step) במקום ריאגנטים מסוג ECL מסורתיים. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבצע חסימה ב-Western באופן יעיל וחסכוני באמצעות מגוון מקיף של מוצרים.

זכרו כי איכות התוצאות שלכם תלויה באיכות הרכיבים שבהם תשתמשו. זהו הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.