אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד את קינטיקת הייצוא הגרעיני של mRNA בתאי יונקים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הזרקה מיקרוסקופית של mRNA או DNA לתוך הגרעינים של תאי תרביות רקמה של יונקים. לאחר ההזרקה המיקרוסקופית, הדגימות מקובעות לאחר תקופות דגירה שונות.

לאחר מכן, ה-mRNA נצבע באמצעות היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (fluorescent in situ hybridization) או FISH. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא דימות התאים וכמימות של כמות הפלואורסצנציה בציטופלזמה ובגרעין. בסופו של דבר, ניתן למדוד את קצב ייצוא ה-mRNA באמצעות שילוב של מיקרו-הזרקה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שלום, אני SRG AV מהמעבדה של אלכס פלאצו (Alex Palazzo) במחלקה לביוכימיה באוניברסיטה של טורונטו. אני סטפן טוסקי (Stefan Toski), גם אני מהמעבדה של פלאצו. אני איימי מהמעבדה של פלאצו ואני חי מהא דוד (Khi Maha David) מהמעבדה של פלאצו.

היום נדגים הליך להחדרת mRNA לגרעינים של תאי תרבית רקמה של יונקים באמצעות מיקרו-הזרקה. כמו כן, נדגים כיצד לצבוע את ה-mRNA באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתר (fluorescent in situ hybridization). אנו משתמשים בהליכים אלו במעבדתנו כדי לחקור את קינטיקת הייצוא הגרעיני של mRNA בתאי יונקים.

אם כן, נתחיל. לפני תאריך ההזרקה המיקרוסקופית, יש לדלל DNA פלסמי שהוכן מראש לריכוז שבין 50 ל-200 micrograms per milliliter בבופר הזרקה. לאחר מכן, הוסיפו לתערובת Oregon Green 488 או OG המצומד ל-70 kilodalton dextran כדי לאפשר את זיהוי התאים המוזרקים.

ה-OG conjugated dextran יעזור לקבוע כמה מהנוזל הוזרק לגרעין וכמה דלף אל הציטופלזמה. סובבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-13,000 G ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות, כדי לשקיע כל חומר חלקיקי שעלול לחסום את קצה המחט. בחרו את שורת התאים של היונקים להזרקה מיקרוסקופית בהתבסס על הקריטריונים המתוארים בפרוטוקול הכתוב.

שבעה תאים משמשים לצורך הדגמה זו. התאים מונחים על ליתיות כיסוי שטופות בחומצה בתוך צלחות פטרי של 30 מילימטר לפחות 24 שעות לפני ההזרקה המיקרוסקופית. באופן אידיאלי, שכבת התאים צריכה להיות בערך 70 עד 90% confluent בזמן ההזרקה כדי לאפשר זיהוי קל של התאים המוזרקים; לפני ההזרקה, גורמים לפגיעה בשכבת התאים באמצעות קצה של פיפטת פלסטיק של 200 microliter.

חקו פצע בצורת צלב על זכוכית הכיסוי והשאירו את התאים להתאושש באינקובטור לתרביות רקמה למשך 15 דקות לפחות לפני ההזרקה. לביצוע המיקרו-הזרקה, השתמשו במיקרוסקופ הפוך המבודד על שולחן אוויר כדי למזער רעידות שעלולות להפריע לתהליך המיקרו-הזרקה. בעזרת טיפ למטען ג'ל של einor, הסירו כ-1 µL מהחלק העליון של הדגימה בצנטריפוגה כדי למנוע פגיעה במשקע.

החדירו את קצה הפפיטה לקצה האחורי של מחט מיקרו-הזרקה מוכנה מראש ופתחו את הנוזל. הנוזל יישאב לתוך קצה המחט באמצעות פעולת נימיות. מניסקוס קרוב לקצה המחט אמור להופיע בתוך חמישה עד 30 שניות.

מקמו את המחט המלאה בנוזל בתוך המוט (wand) והצמידו אותה למיקרו-מניפולטור. בזווית של 45 מעלות, צפו במחט באמצעות עדשה של 10x ומקמו אותה במרכז שדה הראייה בקרבת מישור המוקד. באמצעות כפתורי הכוונון הגס של המיקרו-מניפולטור, המוט מחובר באמצעות צינור למזרק זכוכית, המשמש ליצירת הלחץ הדרוש להזרקת הנוזל מקצה המחט.

כדי לשמור על לחץ קבוע, המזרק מותקן על תפס צינור. באמצעות שני פקקי גומי ושני תפסים ממתכת, הרימו את המחט מספר מילימטרים כדי למנוע את פגיעתה בשלבים מאוחרים יותר, ולאחר מכן החזירו את המיקרוסקופ לאחור. הגבישו את הלחץ על ידי לחיצה על בוכנת המזרק.

0.5 עד שני סמ"ק. הניחו צלחת פטרי המכילה זכוכית כיסוי עם שכבה חד-שכבתי פגועה. על במה הצפייה, הרחיקו את המיקרוסקופ.

הזז את העמוד קדימה למצב זקוף, כך שהקונדנסור יהיה מיושר והמחט תוכל לחדור לנוזל. יש לבצע זאת בזהירות כדי למנוע שבירה של המחט על כיסוי הזריקה. באמצעות עדשת אובייקט 10x, זהה את מרכז הפצע בצורת צלב ומקם את המחט מעל התאים המיועדים להזרקה.

הגדילו את ההגדלה על ידי מעבר לעדשה אובייקטיבית של 40x. לאחר מכן, הורידו ומרכזו את המחט באמצעות כפתורי הכוונון העדין (fine adjustment) בידית השליטה. התחילו את ההזרקה באחת מפינות צלב הפצע על ידי הורדת המחט עד ליצירת מגע עם הגרעין.

לאחר ההזרקה, התא יעבור שינוי ניכר בבהירות המופע (phase brightness). המשיכו לאורך קצה אחד של צלב הפצע. כדי לאפשר זיהוי קל של התאים המוזרקים במהלך ההדמיה, קריטי להתאים כראוי את לחץ ההזרקה עבור כל מחט.

הלחץ חייב להיות גבוה מספיק כדי לחדור את קרומי הפלסמה והגרעין, אך לא גבוה מכדי להרוג את התאים. בצעו מיקרו-הזרקה לתאים לאורך קצה הפצע למשך פרק זמן קבוע. עם תרגול, ניתן להזריק מספר מאות תאים במהלך פרק זמן זה.

במקרה של הזרקה של פלסמידי DNA, דגרו את התאים שהוזרקו במיקרו-מזרק בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לתרביות רקמה למשך 20 דקות לפני הקיבוע, ולאחר מכן הפסיקו את השעתוק. הדבר נעשה על ידי טיפול בתאים ב-1 µg/mL של $\alpha$-amanitin המומס במצע גידול. ריכוז זה מעכב ביעילות שעתוק מפלסמידים שהוזרקו במיקרו-מזרק.

החזירו את התאים לאינקובטור ואפשרו לתאים לייצא את ה-mRNA שסונתז acabado. ניתן להשתמש במחט אחת שוב כדי להזריק למספר זכוכיות כיסוי. עם זאת, יש להחליף את המחט כאשר סוג ה-DNA או ה-RNA המוזרקים במיקרו-הזרקה משתנה.

בנוסף, ברגע שהמחט מוסרת מהמקל (wand), יש להשליכה כדי לקבל מדידה מדויקת של קינטיקה של ייצוא mRNA מהגרעין. יש לקבע דגימות נפרדות בנקודות הזמן: 0 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 60 דקות ו-120 דקות. לאחר הטיפול ב-alpha manin בזמן המתאים, שאבו את מצע הגידול ושטפו את התאים פעמיים בשני מיליליטר של תמיסת PBS.

חשוב לשמור על כיסויי הזריקה (cover slips) לחים על ידי מזעור הזמן שבו הם אינם טבולים בנוזל. קבעו את התאים על ידי הוספת 2 mL של 4% Aldehyde ב-PBS והדגירו את התאים למשך לפחות 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת הדגימות המקובעות פעמיים נוספות, הפכו את התאים למאוורים (permeable) באמצעות 2 mL של 0.1% Triton X 100 ב-PBS; שוב, הדגירו את התאים למשך לפחות 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לבסוף, שטפו את הדגימות פעמיים נוספות כדי להכינן אותן להיברידיזציה. שטפו את התאים פעמיים עם תמיסת שטיפה של 1X SSC המכילה 25 עד 60% formamide. לאחר מכן, הכינו את תא הצביעה להיברידיזציה על ידי כיסוי תחתיתו של Petri dish בנפח 150 מילימטר במים והנחת פיסת parafilm מעל פני השטח.

הסיר את המים על ידי הפיכת הצלחת, ובכך אפשר ל-paraform להיצמד לתחתית הצלחת. הסר ידנית בועות אוויר מכל זכוכית כיסוי המיועדת לצביעה. טפטף באמצעות פיפטה טיפות של 100 µL מתמיסת ההיברידיזציה על ה-paraform.

שימו לב כי יש לבצע אופטימיזציה של כמות ה-formage עבור סוג הדג הספציפי שבו משתמשים, בעזרת פינצטה. הסירו את לביבת הזכוכית עם התאים המקובעים מתוך צלחת הפטרי בקוטר 30 מילימטר. בעזרת נייר סינון Watman, ייבשו את צדו האחורי של לביבת הזכוכית וספחו עודפי באפר מהצד הקדמי מבלי לייבש את התאים.

לאחר מכן, הנח את זכוכית הכיסוי כשהצד הפונה כלפי מטה על תמיסת הדגים. חזור על תהליך זה עבור כל זכוכית כיסוי. לאחר החזרת המכסה לתאי הצביעה, דגור את הדגימות למשך חמש עד 18 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

הכינו מספר תאי שטיפה באופן דומה לאופן שבו הוכן תא הצביעה; עבור כל זכוכית כיסוי, טפטפו באמצעות פיפטה 1 mL של תמיסת שטיפה על הפרפורם של תא השטיפה. לאחר האינקובציה, הוציאו את זכוכיות הכיסוי מתא הצביעה על ידי טפטוף של 1 mL של תמיסת שטיפה. הנוזל אמור להישאב אל מתחת לכל דגימה באמצעות פעולת נימיות לצד זכוכית הכיסוי.

לאחר מכן, הסר את לביבות הכיסוי באמצעות פינצטה והנח כל אחת מהן על טיפה של חוצץ שטיפה שהודגרה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. שטוף כל לביבת כיסוי פעמיים נוספות, לסך הכל שלושה שטיפות לכל לביבת כיסוי. השתמש בפיפטה כדי להעביר 10 עד 30 µL של תמיסת קיבוע עם dappy על גבי זכוכית ששטופה מראש. כל זכוכית יכולה להכיל שתי לביבות כיסוי; בצע זאת באמצעות פינצטה ונייר סינון watman.

ייבשו את גבם של כיסורי הזריקה וספגו נוזלים עודפים מהצד הקדמי של כיסוי הזריקה מבלי לייבש את הדגימות. הניחו כל כיסוי זריקה עם הפנים כלפי מטה על טיפה של תמיסת קיבוע. ניתן לשמור דגימות מקובעות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius.

כאן מוצגות ההשפעות של alpha mantin על תעתוק של DNA פלסמידי מוזרק בתאי פיברובלסט NIH 3T3, אשר טופלו מראש בריכוזים משתנים של alpha mantin. התאים הוזרקו עם TFL s delta i, DNA פלסמידי ו-OG conjugated 70 kilo dextran. כל שורה תואמת לשדה ראייה בודד שצולם עבור OG 70 kilodalton dextran ו-T uts delta I mRNA.

ניכר כי ריכוזים גבוהים של התרופה עיכבו לחלוטין את ייצור הטרנסקריפט של T UTS delta I, בעוד שדבר זה לא נצפה בריכוזים נמוכים יותר. מוצג כאן מהלך זמן של עלות ייצוא גרעיני של mRNA. שבעה תאים הוזרקו עם פלסמיד DNA של T UTS delta i ו-dextran בגודל 70 kilodalton מצומד ל-OG.

30 דקות לאחר ההזרקה, התאים טופלו ב-alpha mantin והודגרו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך zero minutes, 60 minutes ו-120 minutes. לאחר מכן, התאים קובעו ונצבעו באמצעות גשש נגד T UTS delta I mRNA, ובנוסף באמצעות נוגדנים נגד סמן ה-ER trap alpha. כל שורה תואמת לשדה תאים בודד.

לקבלת מידע על האופן שבו ניתן לכמת ייצוא mRNA, אנא עיינו בטקסט המקוון כאן. נקודת הזמן של 120 דקות הוגדלה. כדי להדגים את הקולוקליזציה של mRNA של TFS delta I ברשת האנדופלזמית, מוצג מיזוג (overlay) של mRNA של T UTS delta I בירוק ושל trap alpha באדום. מידע על האופן שבו ניתן לצבוע mRNA באמצעות חלבונים ניתן למצוא בטקסט המקוון.

הראינו לכם כעת כיצד למדוד את קינטיקת הייצוא הגרעיני של mRNA באמצעות מיקרו-הזרקה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי מיקרו-הזרקה מוצלחת מחייבת הכנה נאותה. שלבים מרכזיים כגון הכנת דגימות DNA ו-RNA, משיכת מחטים, כיוון ציוד אופטי ופתרון בעיות במיקרו-הזרקה מתוארים בפרוטוקול הכתוב שלנו.

בעת הדמיה וניתוח של mRNA שהוזרק במיקרו-הזרקה, חשוב שהכימות יוגבל לתאים שקיבלו יותר מ-90% מהנוזל המוזרק אל הגרעין. ניתן להעריך הצלחה של הזרקה גרעינית על ידי ויזואליזציה של התפלגות organ green dextran בגרעין ובציטופלזמה. אנא עיינו בפרוטוקול המקוון שלנו למידע נוסף על תכנון פרובים לדגים ובשימוש בתוכנה לניתוח תמונות לצורך ניתוח התפלגות ה-mRNA בציטופלזמה ובגרעין.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.