ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

המטרה הכוללת של הפרוצדורה הבאה היא להראות כיצד נורמליזציה של ארכיטקטורת התאים ומיקומם, המושגת על גבי תבניות מיקרו-דביקות ספציפיות, מאפשרת אוטומציה קלה של רכישת תמונות ועיבוד תמונות פשוט עם כימות רגיש ואמינ של השפעות תרופות, דבר שאינו בר-השגה על גבי תמיכות קונבנציונליות של לבישי זכוכית. דבר זה מושג על ידי זריעת תאי heli על שבבי SI two הנושאים תבניות מיקרו המסומנות כ-SI three בצורת L. התאים מאמצים צורה משולשת ובונים סיב מאמץ מרכזי הממתח את שני קצות ה-L. תאי התבנית מדגרו לאחר מכן עם lebos statin או הושארו ללא טיפול, ולאחר מכן קובעו ונצבעו כדי להדגים את שלד התא של actin ואת הגרעינים.

לאחר מכן נרכשות תמונות של תאי המיקרו-תבנית (micropattern) ומעובדות באמצעות מאקרו cell ref כדי להפיק ערימה של תמונות לניתוח, ובאמצעות מאקרו hypotenuse כדי לכמת פנוטיפים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות השפעה משמעותית של מינונים נמוכים של BLEs statin על תאי HELOC במיקרו-תבנית, השפעה שאינה ניתנת לגילוי בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים. שלום, ברוכים הבאים.

אנחנו כאן היום כדי להדריך אתכם בפרוטוקול הניסויי שלנו, המסביר כיצד להשתמש בתבניות מיקרו-דביקויות (adhesive micro patterns) לניתוח תאים, וכן כדי להציג לכם נתונים ניסוייים המדגימים את הכימות הפשוט של מינונים נמוכים מאוד של תרופות על גבי תבניות מיקרו-דביקויות אלו. כאשר תראו את תבניות המיקרו הללו לראשונה, תבינו מיד כיצד הן יכולות לפתור בעיות של שונות בלכידת תמונות במהלך ניתוח תאים. זאת משום שבאמצעות מערך של תאים, בדומה למיקרו-מערך (micro array), ניתן להזיז בקלות את במה המיקרוסקופ מתא לתא כדי ללכוד תמונות באופן מדורג.

אך כמובן שזהו אינו היתרון היחיד שתבניות מיקרוסקופיות מציעות. הן מביאות לשיפורים רבים יותר, כיוון שלמעשה, בתבניות מיקרוסקופיות טיפוסיות מסוימות, כגון צורת הצלב או ה-Y, אנו מנרמלים את הארכיטקטורה הפנימית של התא; כלומר, האורגנלות, כישור המיטוזה, השלד התאי ורשתות חלבונים שונות נמצאים כולם באותם מיקומים או באותה אוריינטציה מתא לתא, מה שמקל משמעותית על חיזוי וכימות של השפעות תרופות על תבניות ספציפיות אלו. כעת, הדבר עשוי להיראות כנוגד אינטואיציה ביחס למה שנעשה בדרך כלל בצלחת פטרי קלאסית או במיקרופלטה.

ובכן, מכיוון שבדרך כלל רואים כמובן תאים נעים ומאמצים מורפולוגיות שונות. לעומת זאת, על תבניות המיקרו-הדבקה (adhesive micro patterns), כל התאים יתחילו להיראות דומים מכיוון שהם מגיבים לתבנית המיקרו-הדבקה הזו ומארגנים את הארכיטקטורה שלהם באותה צורה. זה עשוי להיראות למעשה מעט מלאכותי, אך כשבוחנים זאת מקרוב, האם צלחת פטרי אינה מלאכותית אף יותר?

מכיוון שבתוך רקמות, התאים מוגבלים על ידי התאים השכנים וכן על ידי המטריצה החוץ-תאית. לכן הם מקבלים מידע מרחבי רב, המכוון את ארכיטקטורת התא. ובדיוק לשם כך אנו משתמשים בתבניות מיקרוסקופיות (micro patterns).

אנו מחזירים את המידע המרחבי הזה לתאים, וכל התאים מגיבים לכך ומתארגנים באופן דומה. וכעת, מכיוון שכל התאים נראים דומים, אנו יכולים להציג את המושג של תא ייחוס, כלומר שניתן לבצע ממוצע של כל התמונות ולהשיג תמונה אחת, המייצגת נאמנה את מראה התא בתנאי נתון. לאחר מכן ניתן להוסיף תרופה, לבחון שוב את תא הייחוס הזה ולראות כיצד השתנתה המורפולוגיה או הארגון של התא כמענה לתרופה זו.

הנח שני שבבי situ two בנפרד בשני בארות עצמאיות של פלטת שש בארות, תוך וידוא שלוגו ה-situ two קריא. שבבי ה-situ two המשמשים לניסוי זה כוללים תבניות מיקרו צבועות ב-FibroGen SI three ויש לשמור אותם בחשיכה לפני השימוש. אסוף תאי hela הנמצאים בקונופלואנציה של כ-80% באמצעות טריפסין ובדוק תחת מיקרוסקופ שהם מופרדים כראוי. סבב בצנטריפוגה ב-300 G למשך ארבע דקות ותלה את התאים מחדש בעדינות. ספור ומדלל את התאים לריכוז של 15,000 תאים למיליליטר.

במצע גידול D-M-E-M-F 12 לא שלם, חלק 60,000 תאים לכל באר. יש להזיז את הפלטה כמה שפחות כדי למנוע יצירת תנועות סיבוביות במצע, שעלולות לגרום לריכוז התאים במרכז. השאר את התאים לשקוע למשך 10 דקות תחת המנדף, ולאחר מכן העבר אותם לאינקובטור תאים.

בתוך 10 עד 20 דקות באינקובטור התאים, התאים יתחילו להיצמד לאחר 10 דקות; יש לבדוק באופן קבוע תחת המיקרוסקופ מתי התאים נצמדו. החליפו את מצע התאים והסירו עודפי תאים על ידי חזרה על הפרוצדורה הבאה ארבע פעמים. תוך שמירה על הפלטה במצב שטוח, שאבו בעדינות את המצע מצד הבאר.

הקפידו להשאיר מספיק מצע כדי למנוע מהשבב להתייבש. הוסיפו ארבעה milliliters של PBS ובצעו שאיבה החל ממרכז השבב. לאחר מכן, עברו לדופן הבאר כדי לשאוב את רוב ה-PBS כפי שנעשה קודם לכן, ובדקו תחת המיקרוסקופ אם קיימים תאים צפים.

אם נשארת כמות גדולה של תאים צפים, חזור על הליך השטיפה. אם נכונה כמות קטנה מאוד של תאים, שאב חלק מה-PBS והחלף אותו בשני מיליליטר של מצע טרי, וחזור על פעולת השאיבה וההוספה של ארבעה מיליליטר של מצע טרי פעמיים. הדגר את התאים למשך שלוש שעות באינקובטור לתאים כדי לאפשר להם להיפרס באופן מלא.

בשימוש בשיטה זו, בין 10% ל-30% מהתבניות המיקרוסקופיות יאוישו על ידי תא בודד, בעוד שתבניות אחרות יהיו ריקות או מאוישות על ידי מספר תאים. כדי לטפל בתאים ב-BLEs statin, יש לדלל את תמיסת המלאי של התרופה בריכוז 17 millimolar לריכוז סופי של five micromolar עם 0.1%DMSO בארבעה milliliters של מצע. עבור הביקורת, הכין מצע עם 0.1%DMSO בלבד; שאב את מצע התאים והחלף אותו במהירות בתמיסות ה-BLEs statin או הביקורת כדי למנוע מהשבב להתייבש.

דגרו את התאים למשך שעה אחת ב-37 °C. במהלך דגירה זו, הכינו את בופר השלד התאי. הוסיפו 1 g של סוכרוז ל-2 mL של cb.

פעולה זו מסייעת בשימור המבנים התאיים הפנימיים. ערבבו 1 mL של סוכרוז CB עם 4 mL של 5% PFA. הוסיפו 2 mL של תמיסת PFA בסוכרוז CB.

בשתי בארות של פלטת שש בארות חדשה. כדי לקבע את התאים, השתמשו בפינצטה כדי להרים את ה-CY two chip והניחו אותו בפלטת שש הבארות המכילה 2 mL של PFA בתמיסת CB sucrose. דגרו את התאים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, הסירו את ה-PFA ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן שטפו את התאים עם 2 mL של 100 mM ammonium chloride למשך 10 דקות.

כדי להפסיק את פעילות הצליבה השיורית של PFA, הפכו את התאים לחדירים על ידי הוספת שני מיליליטר של PBS המכיל 0.1%tritton X 100 למשך שלוש דקות, שטפו פעמיים עם PBS וצבעו את סיבי האקטין באמצעות שני מיליליטר של ZI המצומד לפלואורסצאין בדילול של 1:2000 ב-PBS עם 1.5%BSA; הדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים פעם אחת עם שני מיליליטר של PBS. בשלב הבא, צבעו את הגרעינים.

הוסף 2 mL של תמיסה בריכוז 1 mg/mL ב-PBS והדגר במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף פעמיים עם 2 mL של PBS. הצמד את שני השבבים לסלייד סטנדרטי באמצעות 25 עד 30 µL של תמיסת קיבוע כגון al.

כדי לרכוש תמונות בשלושה אורכי גל, אנו משתמשים בתוכנת ההדמיה Metamorph ובמיקרוסקופ NIK icon eclipse T. המערכת מצוידת במצלמת CCD Hema Matsu ובמקור תאורה מסוג intens lite mercury fiber. ראשית, יש לבחור בהגדלה של 20x.

בשלב הבא בסרגל התפריטים, פתחו את רכישת הנתונים הרב-ממדית (multidimensional acquisition). כדי להגדיר את הפרמטרים השונים של הניסוי, ציינו תחילה היכן לשמור את הנתונים שלכם.

הגדירו את מספר אורכי הגל לשלושה, בחרו באפשרות SI three wavelength ומקמו את תגית כיסוי הזכוכית כך ש-12 תבניות מיקרו (micro patterns) יהיו ממורכזות בשדה המבט של המצלמה. מספר תבניות המיקרו הנראות בכל שדה ישתנה בהתאם להגדרות המצלמה והעדשה. הגדירו את זמן החשיפה עבור כל אורך גל ובצעו מיקוד אוטומטי (auto focus).

עבור PS three, צור יומן הרצה לרכישת נתונים רב-ממדית ושמור אותו כ-MDA jnl. פתח את פונקציית שלב הסריקה כדי לרכוש 24 תמונות, שכל אחת מהן מכילה 12 תבניות מיקרו. הזן שש עמודות וארבע שורות עם גודל צעד של 400- micron בציר x, ו-300 micron בציר y ב-set journal לביצוע; העלה את היומן MDA jnl ולחץ על scan כדי להתחיל את הרכישה האוטומטית של 24 התמונות בשלושת אורכי הגל.

בסרטון זה, נעשה שימוש בתבניות מיקרוסקופיות בצורת L כדי לעורר יצירה של סיב מאמץ מרכזי בודד של אקטין התומך בחלק הבלתי מחובר של התא, ובכך לפשט את הוויזואליזציה והמדידה של השפעת statin על BLEs בהשוואה לתאים המונחים על fibronectin חלק. לצורך עיבוד ואנליזה אוטומטיים של תמונות, אנו מציגים שני מאקרואים בהתאמה שנכתבו עבור התוכנה בקוד פתוח ImageJ; מהעמדה של ערימת תמונות גולמיות, המאקרו הראשון מבודד תאים בודדים ויוצר תא ייחוס, והמאקרו השני מודד את קריסת ממברנת התא.

השלב הראשון הוא סגמנטציה של תאים בודדים מתמונות הגלם. תמונות התבניות המיקרוסקופיות המסומנות פלואורסצנטית משמשות להגדרת אזורים המרכזים את התבניות המיקרוסקופיות, אשר נגזרים מהתמונות עבור כל אורך גל ומורכבים מחדש למחסניות (stacks) עבור כל אורך גל. כדי לבחור תבניות מיקרוסקופיות עם תאים בודדים, המאקרו מזהה את מספר הגרעינים בכל תמונה ומסיר מכל המחסניות את אלו המכילים יותר מגרעין אחד או ללא גרעינים כלל.

לבסוף, נעשה שימוש בתוסף multi-stack reg של ImageJ כדי ליישר מחדש את כל התמונות שנאספו ואת כל הערוצים בהתבסס על מיקום המיקרו-תבנית. שלב זה יוצר ערימות שורות (line stacks) של תמונות בודדות שניתן להשתמש בהן כעת לצורך ניתוח של תא בודד או ליצירת תא ייחוס. ב-ImageJ, תא הייחוס נבנה על ידי ביצוע הקרנה (projection) של התמונות המסוננות והמיושרות מתוך הערימה.

ניתן להחיל מספר שיטות היטל, אך בדרך כלל נבחר היטל חציוני כדי לסלק ערכים חריגים ממערום התמונות. תא הייחוס הוא כלי ייחודי ומועיל לייצוג ולניתוח תמונות המתקבל אך ורק באמצעות תאים בעלי תבניות מיקרוסקופיות. כדי להקל על בחינתו, מוחל טבלת ערכים (lookup table או LUT) להמרת התמונה חד-צבעית למפת תדרים מקודדת.

כדי לאפיין את השפעת הסטטינים על ה-BLEs, נותחו הקשיחות וקריסת התא באמצעות מאקרו שני של Image J. בקצרה, תמונות סף (threshold images) של מיקרו-התבנית ה-L משמשות להגדרת התמיכה התיאורטית (hypotenuse) של צורת המשולש של התא. לאחר מכן, מבוצע סף של תמונות צביעת האקטין כדי להגדיר את צורת התא.

לאחר מכן נמדד ההבדל בשטח בין היתר התאורטי לבין ממברנת התא הקעורה בפועל; תאים המציגים שטח מתחת ליתר התאורטי נחשבים כקורסים. השפעתם של 5 µM BLEs statin אופיינה על ידי השוואת מספר התאים הקורסים בתנאי טיפול לעומת תנאי ביקורת. מוצגות תמונות טיפוסיות של תאי L micropattern שטופלו ב-BLEs statin או שלא טופלו; התאים קובעו ונצבעו ב-micro patterns.

אקטין וגרעינים מוצגים באדום, ירוק וכחול בהתאמה. שימו לב להשפעת ה-BLEs statin על צורת התא בהשוואה לתנאי הביקורת. כאן מוצגים תאים מייצגים לאחר דגירה עם BLEs statin או ביקורות על פיברונקטין רגיל.

התאים קובעו ונצבעו; האקטין והגרעינים מופיעים בירוק ובכחול בהתאמה. שימו לב לדמיון בין התנאים המטופלים לתנאי הביקורת. מוצגות תמונות טיפוסיות של תאי ייחוס שהתקבלו מתאים שטופלו ב-BLEs statin או מתאים שלא טופלו.

שימו לב לפוטנציאל של גישה זו לתצפית קלה על הפנוטיפ הנחקר. להלן דוגמה לניתוח של השפעות BLEs statin על תאים באמצעות ה-macro hypotenuse. בעוד ש-25% מתאי הביקורת היו קרוסות, נתון זה עלה פי שלושה ל-75% בתאים שטופלו ב-5 $\mu$M של BLEs statin, מה שמשקף את היחלשותו של רשת הקישור המכווצת של ה-actinin.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו תבניות מיקרו-דביקות פותרות מספר צווארי בקבוק בניתוח בעל תוכן גבוה. ראשית, השימוש בתבניות מיקרו-דביקות הפך את תהליך לכידת התמונות והניתוח לפשוט הרבה יותר. שנית, תבניות מיקרו מאפשרות זיהוי של השפעות עדינות מאוד של תרופות במינונים נמוכים מאוד, מכיוון שהן מפחיתות את השונות בין התאים על ידי נורמליזציה של המורפולוגיה וההתנהגות שלהם.

ולבסוף, בהשוואה לאלפי התאים שבדרך כלל נחוצים כדי לקבל תוצאה טובה בניתוח תאים, נדרשים רק עשרות בודדים של תאים כדי לקבל תוצאה אמינה ומשמעותית באמצעות תא הייחוס שלנו.