אנדוקרדיטיס דגם ניסיוני של Methicillin עמיד

המטרה הכללית של הליך זה היא להקים מודל ניסויי של דלקת השספת (endocarditis) זיהומית בחולדות. הדבר מושג תחילה על ידי גידול של aureus והכנת קטטרים ניתוחיים לזיהום. לאחר מכן, מכינים את אזור הניתוח ומרדימים את בעל החיים.

לאחר הרדמת בעל החיים, מוחדר קטטר דרך העורק הקרוטידי הימני לכיוון הלב. השלב הסופי הוא הדבקת בעלי החיים ב-aureus באמצעות הזרקה לווריד הזנב. לבסוף, רקמות המטרה מבודלות ומוכנות לתרבית כמותית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מודל אנדוקרדיטיס מהיר, הוא שניתן להשתמש במודל האנדוקרדיטיס האדום עם מערכת הדימות in vivo Ivus. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפתוגנזה של זיהומים בפה, כגון ארגוניות (virulence) ויעילות של סוכנים אנטימיקרוביאליים. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את הטכניקה יתקשו בביצועה מכיוון שההליך הכירורגי הוא מאתגר.

ראשית, יש להוסיף לולאה מלאה של תרבית M SSA ממלאי מאוזן קפוא למבחנה עם אגר דם כבשים. לאחר וידוא שאין זיהום, יש לדגור את התרבית על צלחת סויה אוגר למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. בחר מושבה אחת מהצלחת והשתמש בה להדבקת 5 mL של מרק תרביות סויה בתוך מבחנה עם מכסה מסוג snap cap בנפח 15 mL.

דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה באינקובטור עם ניעור. כוונו את המכשיר ל-200 RPM. ראשית, הכינו את הקטטרים: גזרו צינורות פוליאתילן לאורך של 10 cm ועקרו את הקטטרים בתמיסת חיטוי cex למשך 30 דקות.

בשלב הבא, המסו קצה אחד של מבחנה סטרילית על ידי לחיצה של הקצה באמצעות פינצטה סטרילית מחוממת, כדי ליצור קטטר שיעבור מהעורק הקרוטידי הימני אל החדר השמאלי ויגרום לנזק לאנדוקרד בעת פעימות הלב. לאחר מכן, הרדימו את החולדה על ידי הנחתה בתא המכיל תערובת של isof fluorine וחמצן ביחס של 1:1 עד להשגת השפעת ההרדמה. ודאו את ההרדמה על ידי בדיקה האם השרירים רפויים והרפלקסים בכפות הרגליים נעלמו.

יש לשמור על מצב של הרדמה במהלך הניתוח באמצעות קונוס אף המחובר לתערובת הגזים. נקה את אזור הניתוח ב-Betadine וב-70%ethanol תוך שמירה על טכניקה סטרילית לאורך כל הניתוח. הנח את החולדה במצב גב (dorsal position) ובצע חתך אנכי דרך שכבת העור של הצוואר מעל העצם הסטרנום (sternum) באמצעות דיסקציה קהה.

הפרידו את הפסציה כדי לחשוף את העורק הקרוטידי הימני. העורק הקרוטידי הימני ממוקם מעט מימין לקו האמצע מעל הבריח. משכו בזהירות את העורק מעלה מתוך חלל הצוואר והניחו שני קטעי תפר משי באורך 10 centimeter תחת העורק כדי לקשור אותו בקצה הצפלי החשוף.

לאחר מכן, הצמד תסביך לעורקי למניעת דימום. צור חור קטן בחלק העליון של העורקי באמצעות מוליך קטטר בעזרת פינצטה. הכנס את הקצה הפתוח של הקטטר דרך החור שנוצר בעורקי.

הסר את התפס והדף את הקטטר כלפי מטה לכיוון הלב. עד למפגש עם התנגדות המעידה על הכנסה נכונה, על הקטטר להימתח ארבעה עד חמישה סנטימטרים אל תוך העורק ולהפעמים עם דפיקות הלב של החולדה. ברגע שהקטטר במקומו, קשור תפר רפוי מסביב לקצה העורק ואבטח את הקטטר במקומו.

בעזרת תפר משי, גזרו את עודפי התפר והקטטר, ולאחר מכן הכניסו את הקצוות מתחת לעור הצוואר. סגרו את העור בעזרת סגורי עור. הניחו את החולדה בכלוב נקי והשאירו אותה במקום חם עד להתאוששות מההרדמה.

ספקו מזון ומים ובדקו את החולדה בתדירות גבוהה, הן במהלך ההחלמה והן אחריה. ניתן לבצע את ההדבקה בין יום אחד לשבעה ימים לאחר הניתוח, אך יש לשמור על עקביות בזמנים בתוך הניסויים. נקו את זנב החולדה עם 70% ethanol והזריקו 0.5 milliliters של תרבית MRSA בתא הרצוי.

הזריק לווריד הזנב. בעזרת מחט במידה 27 באורך חצי אינץ', הפעל לחץ על נקודת ההזרקה עד להפסקת הדימום, לפני החזרת החולדה לכלוב. לאחר השחטת החולדה, נקה את החזה באמצעות 70% ethanol ובצע חתך בצורת V בחזה, מתחת לעצם הסטרנום.

גזרו את סחרוספי הצלעות משני צדדי העצם הסטרנום. כדי לחשוף את הלב, משכו בעדינות את הלב למעלה, גזרו את הרקמה בסמוך לאורטה ובצעו דיסקציה כלפי מעלה כדי לשחרר את הלב. הניחו את הלב בתוך פטרי לסטרילית המרופדת בגזה בגודל ארבעה על ארבעה אינץ', ולאחר מכן בצעו חתך דרך הדופן הפנימית של החדרי השמאלי ופתחו את הלשכה השמאלית.

בדקו כדי לאשש את מיקומו הנכון של הקטטר, ולאחר מכן הסירו אותו. בחנו והסירו צמיחות (vegetations) מהמסתם באמצעות מספריים ופינצטה. הסירו גם את הכליות ואת הטחול, ולאחר שקילה והומוגניזציה של הרקמות והצמיחות, הכינו דילולים סדרתיים ב-PBS לצורך תרבית כמותית.

כאן מוצג קטטר הממוקם נכונה, כפי שמוצג על ידי החץ השמאלי ביותר. הוא משתרע מעבר למסתם האאורטה ואל תוך חלל צדו השמאלי של הלב, וניתן להבחין בצמיחויות (vegetations) רבות סביב מסתמי האאורטה, כפי שמוצג על ידי החצים האמצעי והימני. טבלה זו מספקת דוגמה לרמת העוצמה (virulence) של זן ssus במודל אנדוקרדיטיס בחולדה.

כל בעלי החיים שהוחדרו במוסף של 10⁵ ו-10⁶ CFU פיתחו אנדוקרדיטיס עם צפיפויות גבוהות של ה-ssus בצמיחות לבביות (vegetations) וכן בכליות ובטחול. ברגע שהפרוצדורה הכירורגית זו תישלט, ניתן לבצעה בתוך 10 דקות אם היא מבוצעת כהלכה.

בזמן ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על בעל החיים במצב מוערך במהלך הניתוח שלאחר הפרוצדורה. ניתן לבצע שיטות כגון ivus כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון ניטור בזמן אמת של יעילותם של סוכנים אנטי-מיקרוביאליים והבעת גנים in vivo לאחר התפתחותם. טכניקה זו עשויה להוות דרך עבור חוקרים בתחום ה-step orus וה fiction לחקור את גורמי virulent-pathogenic שלהם בזיהומים אנדו-וסקולריים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להקים מודל ניסויי של אנדוקרדיטיס בחולדות. זכרו כי עבודה עם MRA עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת חלוק מעבדה וכפפות בעת ביצוע פרוצדורה זו.