Assay Clonogenic: תאים חסיד
13 במרץ 2011
תחולתה של assay clonogenic להערכת הכדאיות הרבייה הוקם עבור יותר מ -50 שנה. כאן אנו מדגימים את הנוהל הכללי לביצוע assay clonogenic עם תאים חסיד.
שלום, שמי לום ואני כעת בשלב הדוקטורט שלי במכון BE IDI Heart and Diabetes, תחת השגחתו של ד"ר Tom Carianne, ראש מעבדת הרפואה האפיגנומית. בסרטון זה, אדגים את ההליך המכונה Clonogenic Survival Assay. זוהי טכניקה בת 50 שנה, המאפשרת להעריך את ההשפעה של טיפולים שונים, כגון חשיפה לקרינה או לחומרים כימיים, על החיוניות הרפרודוקטיבית של תאים.
בדיקת הישרדות קונגנית (Congenic survival assay) היא טכניקה מרכזית בביולוגיה של קרינה להערכת הרגישות לקרינה של שורות תאים שונות, ולבדיקת היעילות של תרכובות שונות להגנה מפני קרינה (radioprotective) או לרגישות לקרינה (radiosensitizing). כאשר משתמשים בשורת תאים הדבקים (adherent cell line), בדיקת ההישרדות הקריוגנית מורכבת משלושה שלבים. ראשית, טיפול בשכבה אחת (monolayer) של תאים הדבקים.
שנית, הכנת תרחיף תאים בודדים וזריעת מספר ידוע של תאים בצלחות צביעה, ושלישית, צביעה, ספירה ובדיקת המושבות שנוצרו לאחר תקופת דגירה. בסרטון זה, אשתמש בתאי cino site אנושיים מומסים כדי להדגים כיצד ניתן להשתמש בבדיקת polygenic Bible כדי לקבוע את תכונות ההגנה מפני קרינה של נוגד חמצון טבעי. מראש זורעים תאים ב-25 מיליליטר בקבוקי T-flask ב-5 מיליליטר מצע גידול, כך שביום הניסוי יהיה מיליון תאים לכל בקבוק.
מוסיפים 50 µL מהתרופה בריכוזים שונים לחמישה מ"ל של מצע בכל בקבוק מסומן בהתאם כדי להשיג את הריכוז הנדרש; נעשה שימוש בחמישה ריכוזים ובנוסף בביקורת נשג (vehicle control), שבמקרה זה היא PBS. לאחר הוספת התרופה, התאים מדגברים למשך שעה בתנאים המתאימים לסוג תאי השורה המשמשים. לאחר הדגירה, את הפלקסים, למעט קבוצת הביקורת, מקרינים במינון הנבחר, אשר במקרה זה הוא 4 Gray המופקים ממקור צסיום פולט קרני גמא.
לאחר ההקרנה, שופכים את המדיומים ומשוטפים כל בקבוקון ב-2 mL של PBS למשך חמש דקות. לאחר שפיכת ה-PBS, מוסיפים לכל בקבוקון 2 mL של trypsin בריכוז 0.05% כדי לנתק את התאים הדבקים מהדופן. לאחר מכן, מוסיפים לכל בקבוקון 5 mL של DMEM המכיל 10% fetal bovine serum כדי לנטרל את ה-trypsin.
את כל תכני ה-fasc מעבירים לאחר מכן לפקתות פלקון (Falcon) של 10 מיליליטר המסומנות. עם השלמת הפעולה, סובבים את הפקתות הללו בצנטריפוגה למשך חמש דקות, ולאחר מכן שופכים בזהירות את העלייה (supernatant) מבלי להפריע למשקע, ומוסיפים חמישה מיליליטר של מצע crecy לכל פקתות.
לדוגמה, עבור קבוצת הביקורת, זורעים 100 תאים לכל צלחת, כך שהנפח הדרוש כדי להגיע ל-500 תאים ל-25 מיליליטר מחושב עבור דגימות ריכוזיות יותר; בצעו דילול פי 10 או דילול סדרתי פי 100 כדי למזער את השגיאה הכרוכה בשימוש בנפחים קטנים מ-100 מיקרוליטר. כעת מכינים את הנפח שחושב קודם לכן בתוך מבחנת פלקון המכילה 25 מיליליטר מצע גידול עבור כל דגימה. כעת ניתן להעביר את הדגימות לצלוחיות שסומנו מראש, ולהוסיף חמישה מיליליטר לכל צלחת כדי להקל על הטיפול וההובלה.
אחסנו את הצלחות בתוך מכל גדול, סטרילי או חטוי. לאחר מכן, העמידו את הצלחות באינקובטור עם לחות בתנאים המתאימים והדגירו אותן למשך שמונה ימים. אם אתם משתמשים בקרטינוציטים לאחר שמונה ימים, הוציאו בזהירות את הצלחות מהאינקובטור והניחו אותן אחת אחת בתוך מapay מנדף כימיים.
הקפידו לטפל בצלחות בעדינות כדי שלא להפריע למושבות שנוצרו. הסירו את המכסים והוסיפו לכל צלחת 5 mL של תמיסת סלין 0.9% לצורך שטיפה. כוונו את קצה הפספס לפינת הצלחת והימנעו ממגע בתחתית הצלחת כדי למנוע גירוד מקרי של המושבות.
לאחר חמש דקות, שאבו בזהירות את התמיס הפיזיולוגי. כעת, קבעו את המושבות באמצעות שלושה מיליליטרים של פורמולה בריכוז 4%, ויש להחליף את הפקקים כדי למנוע התאיידות. לאחר 15 דקות עד חצי שעה, שאבו את הפורמולה והשליכו אותה באופן המתאים.
המושבות מוכנות כעת לצביעה ב-0.1% Crystal violet; מוסיפים חמישה מיליליטרים לכל צלחת ומחזירים את המכסים לאחר חצי שעה עד שעה. לאחר מכן שוטפים את הצבע במים מזוקקים, הופכים את הצלחות ומניחים להן להתייבש למשך לילה. המושבות מוכנות כעת לספירה.
ניתן לספור את המושבות באופן ידני באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי. כל צבר תאים המכיל 50 תאים או יותר נחשב למושבה. ובכך מסתיימת הדגמת בדיקת ההישרדות הקונגנית (Congenic survival assay).
היתרון המרכזי של בדיסה זו על פני טכניקות אחרות הוא רגישותה הגבוהה ביותר, המאפשרת לזהות הישרדות בטווח רחב, גם לאחר השמדה של שש סדרי גודל (six logs) של תאים. רגישות זו מושגת על ידי זריעת מספרים גדולים יותר של תאים. ניתן להשתמש בבדיסה זו בקלות למטרות אחרות, כגון בדיקת ציטוטוקסיות.
תודה לצפייה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
בדיקה קלונוגנית (clonogenic assay) היא טכניקה מוכרת להערכת חיוניות רבייתית של תאים, במיוחד כמענה לטיפולים שונים. מאמר זה מפרט את הפרוצדורה הכללית לביצוע הבדיקה הקלונוגנית עם תאים נצמדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה של קרינה
- הערכת חיוניות רבייתית
רקע
- בדיקת היכולת הקלונוגנית נמצאת בשימוש כבר למעלה מ-50 שנה.
- היא מעריכה את ההשפעה של טיפולים כגון קרינה או חשיפה לכימיקלים על תאים.
- טכניקה זו היא קריטית להערכת הרגישות לקרינה בשורות תאים שונות.
- היא מסייעת בבדיקת היעילות של תרכובות רדיו-מגנות או מרגישות.
מטרת המחקר
- להדגים את הליך בדיקת השרידות הקלונוגנית.
- להדגיש את חשיבותה בביולוגיה של קרינה.
- לספק תובנות לגבי תגובות תאיות לטיפולים שונים.
שיטות בשימוש
- טיפול בשכבה אחת של תאים נצמדים.
- הערכת החיוניות הרבמתיקה של תאים לאחר טיפול.
- הערכת הרגישות לקרינה של קווי תאים שונים.
- בדיקה של תרכובות המגנות מפני קרינה או מגבירות רגישות לקרינה.
תוצאות עיקריות
- בדיקה קלונוגנית מעריכה ביעילות את החיות הרבייתית של תאים.
- טיפולים שונים עשויים להשפיע באופן משמעותי על הישרדות התאים.
- התוצאות יכולות לסייע בפיתוח של אסטרטגיות הגנה מפני קרינה.
- הפרוטוקול ישיים עבור קווי תאים הדבקיים שונים.
מסקנות
- בדיקה קלונוגנית נותרת כלי חיוני בביולוגיה תאית.
- היא מספקת תובנות חיוניות לגבי השפעות של קרינה וחומרים כימיים על תאים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מתודולוגיה זו כדי להעמיק את ההבנה של תגובות תאיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
בדיקת היכולת הקלונוגנית (clonogenic assay) היא כלי בסיסי לכימות החיוניות הרבייתית של תאים לאחר חשיפה לקרינה או לסוכנים ציטוטוקסיים, והיא מספקת מידע ישיר לתהליכי המחקר בשלבים מוקדמים באונקולוגיה וברדיובלוגיה. הרגישות של בדיקה זו מאפשרת הערכה מהימנה של השפעות הטיפול על הישרדות תאים, ובכך היא תומכת בביטחון חיזוי באימות המטרה ובצמצום סיכונים מכניסטיים. בדיקה זו מהווה בסיס להחלטות קריטיות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) עבור תרכובות מועמדות וסוכנים המשנים את השפעות הקרינה בתיקי מחקר פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה כמותית של התגובה התאית להפרעות גנטיות, כימיות או מבוססות קרינה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין השפעות ציטסטטיות להשפעות ציטוטוקסיות ברמת התא הבודד.
- מספק תיקוף תפקודי של מטרות מועמדות או מסלולים המשפיעים על הישרדות תאים ועל שגשוגם.
- מסייע במיון תיקי תרופות באמצעות זיהוי תרכובות בעלות פרופילים אנטי-פרוליפרטיביים או הגנתיים חסונים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס מערכות מהימנות וניתנות לשחזור להערכת יעילות תרכובות ורגישות לקרינה על פני קווי תאים שונים.
- מספק תוצאות כמותיות סטנדרטיות, כגון יעילות זריעה (plating efficiency) ושברון הישרדות (survival fraction), לצורך השוואה בין מחקרים.
- מאפשר זיהוי ברגישות גבוהה של השפעות טיפול, ובכך תומך בסריקה מהימנה ובניתוחי תגובה למינון.
- מכין מערכות ביולוגיות למחקרי מנגנון או למחקרי תרגום (translational studies) בהמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתוני הישרדות in vitro למודלים פרה-קליניים לצורך רציפות תרגומית במחקרי אונקולוגיה והגנה מפני קרינה.
- תומך בקידום של תרכובות מותאם-סיכון, באמצעות אספקת מדדי חיוניות ניבויים תחת חשיפות רלוונטיות מבחינה קלינית.
- מסייע בפיתוח סמנים ביולוגיים (biomarkers) על ידי הצלבת תוצאות הישרדות עם נקודות קצה מולקולריות או פנוטיפיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקת היכולת הקלונוגנית ממוקמת בנקודת המפגש בין שלבי הגילוי המוקדמים, זיהוי המולקולה המובילה (lead identification) והתיקוף הפרה-קליני, ומשמשת כגשר בין מחקרים מכניסטיים למחקר תרגומי באונקולוגיה וברדיובלוגיה.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת את ההשפעה של התערבויות מועמדות על קיבולת הרבייה התאית, ובכך מבהיר את הרלוונטיות של המסלול ואת הסיכון הביולוגי.
- סריקה: מספקת נתוני הישרדות כמותיים הניתנים לשחזור לצורך דירוג תרכובות ואופטימיזציה של מינונים.
- אנליטיקה: מפיקה שברי הישרדות ויעילות זריעה, המאפשרים השוואה סטטיסטית בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מסייע בבחירת מודלים פרה-קליניים ובסנכרון ביומארקרים על ידי קישור הישרדות in vitro לתוצאות in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה, הניתנת להתאמה לקווי תאים שונים ולשיטות טיפול מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור תוכניות של אונקולוגיה והגנה מפני קרינה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה של הבדיקה, הדירות ויכולת הרחבה (scalability) בין צוותי מו"פ.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go), תוך אופטימיזציה של הקצאת משאבים והפחתת הסיכון לנטישה בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של תרכובות מועמדות והתערבויות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים, כימות מושבות וניתוח סטטיסטי של נתוני הישרדות.
- נדרשת גישה לציוד הקרה, לתשתית לתרביות רקמה ולפרוטוקולים מתוקפים לצביעה וספירה.
- נדרש סטנדרזציה בין-צוותית של נהלי הזריעה, הדגירה והדירוג לצורך הדירות.
- ניתן להתאמה לקווי תאים דבקים שונים, אך עשוי להידרש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור מודלים ספציפיים.
- התפוקה והספירה הידנית עלולות להגביל את יכולת ההרחבה עבור ספריות תרכובות גדולות או סריקות בעלות תוכן גבוה (high-content screens).
