iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשיג מפה של אתרי הקישור של חלבון קושר RNA לכל אורך הטרנסקריפטום ברזולוציה של נוקלאוטיד בודד. דבר זה מושג על ידי הקרנת UV של תאים חיים כדי ליצור קשרי צלב קוולנטיים בין חלבונים ל-RNA in vivo כשלב שני. החלבון קושר ה-RNA מטוהר באופן אימונולוגי תחת תנאים מחמירים כדי להפיק את מקטעי ה-RNA שנוצרו בהם קשרי צלב.

שעתוק הפוך הבא מייצר cDNA שנוטה להיקטע במיקום הפפטיד המחובר, דבר המשמר את המידע על מיקום הקשירה הצולבת בתוך ה-RNA. התוצאות המתקבלות מראות את כל אתרי הקישור בתוך התעתוק (transcriptome) על בסיס ריצוף בסביבתו גבוהה (high throughput sequencing) של ספריית ה-cDNA. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של ה-RNA, כגון האופן שבו יחסי הגומלין בין חלבוני RNA שונים מווסתים את עיבוד ה-RNA. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הגברת הביצועים והרזולוציה של מפות אינטראקציות חלבון-RNA ברחב התעתוק. כדי להתחיל, נבצע את הליך הקשירה הצולבת ב-UV לתאי תרבית רקמה.

הסיר את המצע מתוך צלחת בקוטר 10 סנטימטרים של תאי healer. הוסף שש מיליליטר של PBS קר במי קרח והנח את הצלחות על קרח. צלחת אחת מספיקה לשלושה ניסויים.

הסיר את המכסה והקרן את התאים. לאחר הקרנה באורך גל של 254 nanometers עם 150 millijoules per centimeter squared, אסוף את התאים על ידי גירודם מהצלחות באמצעות cell lifter. העבר 2 mL של תרחיף תאים לכל אחד משלושה מיקרו-מבחנות כדי לשקיע את התאים. סבב אותם במהירות מקסימלית למשך 10 שניות בטמפרטורה של 4 °C.

לאחר מכן הסירו את ה-supinate snap, הקפיאו את משקעי התאים על קרח יבש ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 °C עד למועד השימוש. הוסיפו 100 µl של protein A dyna beads לכל ניסוי למבחנה זעירה (micro tube) חדשה. אם אתם עובדים עם נוגדנים מעכבר או מעז, השתמשו ב-protein G dyna beads.

שטפו את החרו지를 פעמיים עם באפר ליזיס (lysis buffer), שניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב המצורף. השעיקו מחדש את החרוזים ב-100 microliters של באפר ליזיס עם שתי עד 10 micrograms של נוגדן. סובבו את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות.

לאחר מכן, שטפו את החרוזיים שלוש פעמים עם 900 µl של לysis buffer והשאירו אותם בשטיפה האחרונה עד שתהיו מוכנים להמשיך. לצורך immunoprecipitation של תאי Thor, הניחו אותם על קרח. השעו אותם ב-1 mL של lysis buffer והעבירו אותם למיקרו-מבחנה של 1.5 mL.

הכינו דילול של 1:500 של RNAs one. לאחר מכן, הוסיפו 10 µL יחד עם 2 µL של turbo DNAs ל-cell.Lysate. דגרו את הדגימות למשך שלוש דקות בדיוק ב-37 °C, תוך ניעור ב-1,100 rpm, והעבירו מיד לקרח.

לאחר מכן, סבבו את הדגימות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ובכוח צנטריפוגלי של 22,000 ×g למשך 20 דקות כדי להשקיע את השקיעות. אספו בזהירות את העלנוסף (supernatant), והשאירו כ-50 µL מהליזאט עם המשקע כדי להשקיע את החרוזים. הסירו את בופר השטיפה, ולאחר מכן הוסיפו את ליזאטי התאים שהוכרו. סובבו את הדגימות למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

השליכו את סוכן ה-SUP ושטפו את החרוצים פעמיים עם 900 microliters של בופר מלח גבוה (high salt buffer), שניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב המצורף. לבסוף, שטפו את החרוצים פעמיים עם 900 microliters של בופר שטיפה (wash buffer). לאחר מכן, המשיכו לדה-פוספורילציה ולהוספת לינקר לקצוות ה-three prime של ה-RNA.

כדי לסמן את הקצוות החמישיים (5') של ה-RNA, עבדו מאחורי מגן פרספקס. הסירו את העלייה מהשטיפה האחרונה של תגובת הליגציה של המקשר (linker) והשביו שנית את החרו지를 ב-8 µL של תערובת PNK חמה. דגרו למשך חמש דקות ב-37 °C.

הסר את תערובת ה-PNK החמה והשתמש בה שוב. השהה את החרוזים ב-20 µL של תמיסת טעינה לג'ל (page loading buffer) בריכוז 1X. לאחר מכן, דגרי את הדגימה בטרמו-מיקסר בטמפרטורה של 70 °C למשך 10 דקות.

הנח מיד את הדגימה על מגנט כדי להשקיע את החרו지를 הריקים. טען את הדגימות על ג'ל SDS-PAGE בריכוז של 4% עד 12% בהתאם להוראות היצרן.

בנוסף, טענו 5 µL של סמני גודל חלבון צבועים מראש. הריצו את הג'ל למשך 50 דקות במתח של 180 V. העבירו את קומפלקסאות החלבון-RNA מהג'ל לממברנת ניטרוסלולוז באמצעות מכשיר ההעברה הרטוב NOVA, בהתאם להוראות היצרן.

לאחר ההעברה, שטפו את הממברנה בבופר PBS. לאחר מכן, עטפו אותה בניילון נצמד וחשפו אותה לסרט בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. בצעו חשיפות למשך 30 דקות, שעה אחת ולילה שלם.

בשלב הבא, בודדו את אזור הממברנה בהתאם לקומפלקסים של חלבון ו-RNA מה-RNAs הנמוכים. בצעו את הניסוי תוך שימוש באוטורדיוגרף כמסכה. השחריו את ה-RNA מהממברנה באמצעות עיכול ב-proteinase K ומיצוי בפנול-כלורופורם.

בצעו תעתוק הפוך של ה-RNA באמצעות אחד מפריימרי ה-AYP כדי לטהר את ה-CDNA באמצעות ג'ל. ערבבו שש מיקרוליטרים (6 µL) של דגימת CDNA עם שש מיקרוליטרים (6 µL) של תמיסת טעינה TBE urea בריכוז פי 2. בצעו זאת רגע לפני טעינת הדגימות על הג'ל.

חממו את הדגימות ל-80 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, העמיסו את הדגימות על ג'ל urea 6%TBE מוכן מראש, יחד עם ס marker של משקל מולקולרי נמוך. הניחו לג'ל לרוץ במשך 40 דקות במתח של 180 volts, כפי שתיאר היצרן, תוך שימוש בצבע העליון ובסימונים על תמיכת הג'ל מפלסטיק כדי להנחות את החיתוך.

גזרו שלושה פסים באורכים של 120 עד 200 נוקלאוטידים, 85 עד 120 נוקלאוטידים ו-70 עד 85 נוקלאוטידים. שימו לב כי ה-arc lip primer ורצף ה-L three יחד מהווים 52 נוקלאוטידים מרצף ה-clip. הוסיפו 400 µL של te ומעכו את פרוסת הג'ל לחתיכות קטנות.

בעזרת בוכנה של מזרק של 1 ml, דגרו את פיסות הג'ל תוך써 ניעור ב-1,100 סל"ד למשך שעתיים ב-37 °C. הניחו שני מסנני זכוכית מקדימים של 1 cm בעמודת CoStar spinx. העבירו את החלק הנוזלי של הדגימה לעמודה וסבבו בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-13,000 סל"ד אל תוך מבחנה של 1.5 ml.

הוסיפו 0.5 µL של glyco blue ו-40 µL של sodium acetate pH 5.5. לאחר מכן, ערבבו את הדגימה. הוסיפו 1 mL של 100% ethanol.

ערבבו שוב והשקיעו את הדגימה למשך לילה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לבסוף, בצעו מעגול (circularize) של מולקולות ה-CD NA כדי לחבר את אזור האדפטור לקצה ה-five prime. לאחר מכן, בצעו ליניאריזציה מחדש והגברה באמצעות PCR לפי הפרוטוקול הכתוב המצורף לפני ריצוף ספריית ה-eye clip; ניתן לעקוב אחר הצלחת הניסוי בשני שלבים.

בצילום הרדיוגרף של קומפלקס החלבון-RNA לאחר העברה לממברנה ובתמונת הג'ל של תוצרי ה-PCR, עבור דגימות בעלות ריכוז RNA נמוך, יש להבחין בפעילות רדיואקטיבית מפוזרת מעל המשקל המולקולרי של החלבון; עבור דגימות בעלות ריכוז RNA גבוה, פעילות רדיואקטיבית זו תהיה ממוקדת יותר קרוב למשקל המולקולרי של החלבון. כאשר לא נעשה שימוש בנוגדן בשלב האימונו-משקבית (immunoprecipitation), לא אמור להיראות אות כלשהו.

בקרות חשובות נוספות לסגוליות של immunoprecipitation כוללות או הקרנה של UV או שימוש בתאים שאינם מבטאים את החלבון הנחקר. תמונת הג'ל של תוצרי ה-PCR צריכה להראות טווח גדלים התואם לפרקציית ה-CD NA. שימו לב כי הפריימרים של ה-PCR, P three Celexa ו-P five Celexa, מוסיפים 76 נוקלאוטידים נוספים לגודל של ה-CD NA. אם לא נעשה שימוש בנוגדן במהלך ה-immunoprecipitation, לא אמור להיווצר תוצר PCR תואם.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שכל אחד מ-64 השלבים הוא קריטי ויש לבצעו בדיוק של מאה אחוזים. ניתן לשלב נתוני ICL באופן חישובי עם בדיקות תפקודיות של כלל התמלילים (transcriptum wide). הדבר יכול, למשל, לספק תובנות לגבי הבקרה של עיבוד RNA התלויה במיקום.

עבור ניתוח נתונים חישובי, אנו ממליצים לעיין בפרסומינו האחרונים שנכתבו בשיתוף פעולה עם Nicholas KA מהמכון האירופי לביואינפורמטיקה ועם bla zupan מאוניברסיטת Liana. וכעת הגיע הזמן שתתחילו בניסויים שלכם. תהנו.