ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

פרוצדורה זו בוחנת את ההשפעות של small GTP ACEs על תעבורת ממברנה מקוטבת. ראשית, הזרק במקביל פלסמידי DNA המקודדים את ה-small GTP ACE ואת חלבוני הדגמי (reporter proteins) לתוך גרעיני תאים של תאים מקוטבים. לאחר מכן, בצע ביטוי של ה-DNA בטמפרטורות שיעצרו את חלבוני הדגמי ברשתית התוך-פלזמית (endoplasmic reticulum) או ב-TGN, בעוד ה-small GTPA מצטבר בציטוזול; המשך במעקב (chase) אחר חלבון הדגמי אל פני השטח של התא בנוכחות cyclo heide כדי למנוע סינתזת חלבונים נוספת.

לבסוף, סמנו את חלבון הדגגל על פני השטח של התא לצורך ניתוח אימונופלורסצנציה. תוצאות המתקבלות מבדיקה זו מאפשרות ויזואליזציה של השינוי במיקום על פני השטח באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טרנספקציה הוא שבמהלך זמני ביטוי-יתר הקצרים המושגים באמצעות מיקרו-הזרקה, אפקטים משניים הם מינימליים, מה שמאפשר לנו לחקור את האפקטים הראשוניים של החלבונים הנבדקים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בתחום קוטביות התא, כגון האופן שבו gtpa קטן מווסת תעבורה ממברנלית מקוטבת. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את השלבים הבודדים הדרושים למיקרו-הזרקה מוצלחת קשה להסביר ללא עזר חזותי. בודדו DNA של פלסמיד נקי מאנדוטוקסינים באמצעות ערכת Sigma Aldrich endotoxin free maxi prep בהתאם לפרוטוקול היצרן. עבור ניסוי זה, השתמשו בשלושה מסנני Transwell שקופים של 12 מילימטר עם גודל נקבים של 0.4 µm לתרבית.

מניחים ארבע פעמים 10 של תאי MDCK חמישיים על כל מסנן. לאחר יומיים, בוחנים את התרבית תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים גדלים בשכבה אחת סגורה (monolayer). להזרקה מיקרוסקופית.

ביום ההזרקה המיקרוסקופית (microinjection), הכין פלטות של 360 על 15 מילימטר עם חמישה ליטרים של מצע גידול MM בתוספת 15 מילימטר heis והנח אותן באינקובטור בטמפרטורה של 39 מעלות צלזיוס. בנוסף, הכין שלוש פלטות בעלות 12 בארות עם מיליליטר אחד של מצע גידול MEM בתוספת 50 millimolar heis ו-0.1 מיליגרם למילליטר cycloheximide, והנח אותן באינקובטור בטמפרטורה של 31 מעלות צלזיוס. הפעל את מיקרוסקופ ההזרקה המיקרוסקופית, הגדר את המיקרוסקופ ההפוך עם במה מחוממת, עדשות אובייקטיביות של 10x ו-32x, ומערכת einor femto jet.

הגדירו את הבמה המחוממת ל-39 °C. פתחו גם את אספקת מיכל גז החנקן לשולחן האוויר. כעת, דללו את ה-DNA במים מסוננים לריכוז סופי של 0.2 mg/mL.

לאחר מכן, סובב את ה-DNA במיקרו-צנטריפוגה ב-13,000 RPM למשך 30 דקות. הסר את החלק העליון והעבר אותו למבחנה חדשה. לאחר מכן, הכן את תאי ה-MDCK על ידי הוצאת המסנן הראשון מתוך צלח התרבית באמצעות להב נישור, גזור את המסנן מתוך תומך המסנן והנח אותו בתוך פלטה מוכנה של 60 על 15 מילימטר המכילה חמישה מיליליטר של מצע גידול MEM מחומם ל-39 מעלות צלזיוס בתוספת 50 מילימולר heis.

כדי להכביד על המסנן בצלחת התרבית, הניחו את הלהב הכירורגי במרכז המסנן ולאחר מכן העבירו את צלחת התרבית אל הבמה המחוממת של המיקרוסקופ. טענו 2-3 µL של ה-DNA המדולל לתוך מחט למיקרו-הזרקה. סובב את כיסוי ההגנה של המחט והניחו לו ליפול לרצפה.

כדי להציב את המחט במחזיק, לחצו על מקש התפריט של המזרק וודאו שהשסתום סגור. הבריגו את המחט לתוך המחזיק שלה. היזהרו לא להבריג את המחט חזק מדי.

מכיוון שדבר זה עלול להוביל לשבירה, לחץ שוב על מקש התפריט. כך, לחץ הפיצוי המופעל ימנע מהמדיום להישאב לתוך המחט במהלך הליך המיקרו-הזרקה. לבסוף, הקש על הג'ויסטיק כדי למחוק את הגדרות ה-homing השמורות ולהוריד את המחט אל התאים.

השתמש בעדישה עם הגדלה של 10x והבא את המחט אל תוך קרן האור מעל הנוזל. כעת התמקד בתאים. בצע מיקוד למעלה שוב על ידי סיבוב גלגל המיקוד ב-180 מעלות כלפי מעלה ואתר את המחט.

הביאו את המחט למיקוד באופן איטי. לאחר מכן, הוציאו אותה שוב מהמיקוד. עבדו לקראת הבאת התאים למתח מיקוד שוב.

הביאו שוב את המחט למיקוד. חזרו על הפעולה עד שהמחט תיגע בפני השטח של המצע, נקודה שבה נצפה הילה. המשיכו עד להגעה לנקודה שבה התאים נמצאים במיקוד, אך המחט עדיין מטושטשת מחוץ למישור המיקוד.

כעת עברו לעדשה עם הגדלה של 32x ובצעו כיוונון גס. הגדירו את גבול ה-Z על ידי נגיעה בממברנה האפיקלית עם קצה המחט והחסרת כ-10 micrometers. זאת כיוון שהגרעינים שוכנים בעומק של כ-10 micrometers מתחת לממברנה האפיקלית.

כעת הוציאו את המחט מספר מיקרונים ממישור המוקד במהירות המקסימלית. כוון את המחט מעל הגרעין, לחצו ושחררו את כפתור ההזרקה של הג'ויסטיק. התחילו ב-95 PSI כדי למצוא את לחץ ההזרקה המתאים.

אם הלחץ גבוה מדי, התאים מתפוצצים. אם הלחץ נמוך מדי, נקודה לבנה נשארת, אך שום דבר אחר לא קורה. בצעו הזרקה מוצלחת הכוללת שינוי פאזה ללא שינוי בגודל התא.

הזריקו 100 עד 500 תאים לתוך החור של הלהב הכירורגי המונח על התאים. לאחר מכן, הניחו את התאים יחד עם צלחת התרבית והלהב הכירורגי בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 39 °C והדגריו למשך שעתיים. לבסוף, העבירו את התאים לפלטת 12 בארות מוכנה המכילה 1 ml של MEM בתוספת 50 mM של 0.1 mg/mL cycloheximide והדגריו למשך שעתיים בטמפרטורה של 31 °C.

כדי למנוע הלבנה (bleaching) של אות ה-GFP המבוטא, הגנו על הדגימות מאור על ידי כיסוי בנייר אלומיניום במהלך כל ההליכים הבאים לצביעת פני השטח. הניחו את התאים, בתוך צלחת תרבית, על פלטת מתכת בקרח ובצעו שטיפה אחת עם PBS++ קר מאוד. הניחו פיסת פאראפורם (paraform) נקייה על פלטת המתכת שבקרח, וטפטפו באמצעות פיפטה טיפות של 30 µL של נוגדן המזהה את הדומיין החיצוני (ecto domain) של החלבון הנחקר.

כעת הניחו את המסנן המכיל את התאים כשהוא הפוך על הטיפה, והוסיפו מספר טיפות של נוגדן על גבו של המסנן. דגרו למשך שעה אחת על קרח. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS++ קר מאוד וקבעו אותם עם 3% paraformaldehyde למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

המשיכו לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS plus plus והמתינו חמש דקות להשגת שיווי משקל ב-PBS plus plus. כעת הדגירו את התאים בבופר חסימה חדיר (blocking permeable buffer). הדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, דללו נוגדנים ראשוניים ביחס של 1:200 ב-BPB כדי לזהות את RAB GTP ACE המבטא, סובבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-13,000 RPM והעבירו באמצעות פיפטה 30 µL של תמיסת הנוגדנים על גבי זכוכית נקייה המונחת בתא לחות.

הניחו את התאים על המסנן, כשהם פונים כלפי מטה, על טיפות הנוגדנים והדגירו למשך שעה אחת. בטמפרטורת החדר, החזירו את התאים למצב זקוף לתוך פלטת 12 בארות ושטפו חמש פעמים במשך 30 דקות עם BPB בטמפרטורת החדר, לאחר הדגרה עם נוגדנים שניים מתאימים, כולל שלב שטיפה.

טבול את התאים שעל המסנן שלוש פעמים במים דה-יוניים והנח אותם עם הצד הימני כלפי מעלה על שקופיות מיקרוסקופ עם 10 µL של חומר קיבוע. הנח זכוכית כיסוי מיקרוסקופית בגודל 18 על 18 מילימטר למעלה, ובעזרת נייר סופג לחץ בעדינות את זכוכית הכיסוי על התאים. לבסוף, אטום בעזרת לק. בהזרקה מדומה של הפלסמיד המקודד ל-V-S-V-G-T-S-O 45 GFP בלבד, החלבון מועבר למשטח הבזולטרלי של תאי MDCK מקוטבים היטב, כפי שניתן לראות לפי הצביעה האדומה של המשטח בתאים שאינם מקוטבים היטב.

חלק מחלבון היתוך ה-GFP יגיע לממברנה האפיתלית. אם דגימות הביקורת נראות כך, לא ניתן להסתמך על הנתונים ויש לחזור על הניסוי עם תאים בעלי קיטוב טוב יותר. שימו לב שלא כל חלבון היתוך ה-GFP המבוטא מגיע לממברנה הבסולטרלית במהלך המרדף בטמפרטורה של 31 °C, כפי שמעיד האות הירוק התוך-תאי הנרחב עבור החלבון הכולל. לאחר השליטה בטכניקה, היא אמורה לארוך כ-10 עד 12 שעות לאחר פיתוחה.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תעבורת ממברנות לבחון חלבוני בקרה בתאים אפיתליאליים מקוטבים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן ביטויי החלבונים בתאים אפיתליאליים מקוטבים באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה.