PGS אלסטומרי פיגומים להנדסת רקמות העורקים

סרטון זה מציג כיצד לייצר פיגומים צינוריים נקבוביים ולהעביREM אותם התנייה מכנית דינמית עבור הנדסת רקמות עורקים. פעולה זו מבוצעת תחילה על ידי ייצור הפיגומים באמצעות אלסטומר מתכלה ושיטת היתוך תרמי. לאחר מכן, הפיגומים מוכנים לזריעת תאים ומורכבים לתוך מערכת של ביו-ראקטור.

בביוראקטור, תאי שריר חלק של כלי דם נזרעים על הפיגומים ומגודלים. שבועות לאחר מכן, הרקמה נאספת ונבדקת באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, צביעת H&E ואוטופלואורסצנציה של אלסטין. השריר החלק שהתקבל הוא רב-שכבתי ומכוון באופן ניצב.

היתרון המרכזי של טכניקה זו, בדומה להסרת חלקיקים (particulate leaching), הוא השימוש בתבנית זכוכית ליצירת פיגום צינורי נקבובי מחומצה היאלורונית. לאחר הסרת התבנית, מוכן פיגום התבנית מחתיכת צינור זכוכית. הניחו את הצינור במחזיק ושפכו לתוכו תמיסת חומצה היאלורונית שהוכנה ביום הקודם.

חומצה ההיאלורונית זורמת לאט לאורך הדופן הפנימית. כאשר היא מגיעה לתחתית התבנית, הפכו את התבנית. חזרו על שלב זה עד שהדופן הפנימית של התבנית תצופה באופן אחיד בתמיסה.

לאחר הציפוי, ייבשו את כל תבניות הזכוכית שהוכנו בתנור ואקום בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות. בדרך כלל, מכינים ארבע תבניות בו-זמנית בזמן שהתבניות הזכוכית מתייבשות. הכינו את מזיגות חלקיקי המלח, וטחנו את חלקיקי ה-SVE salt לגודל של 25 עד 32 µm.

למחרת, הרכיבו את המנדרל של תבנית הזכוכית שהוכנה, את צינור ה-PTFE, את השרוול המתכווץ בחום ואת טבעת ה-PTFE. ראשית, הכניסו את המנדרל לתוך קטעי צינור PTFE באורך 65 millimeter ואפו אותם בטמפרטורה של 120 degrees Celsius למשך חמש דקות. כדי לכווץ את ה-PTFE, חממו מראש אינקובטור היברידיזציה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 דקות לפחות.

לאחר שהצינור עטף את המנדרלים, דחפו את שרוול הבידוד המכווץ בחום על המנדרל כך שייענץ בחופשיות. לאחר מכן, הניחו את המנדרל בתוך תבנית הזכוכית וחברו טבעת A-P-T-F-E לתחתית המנדרל. ודאו שטבעת ה-PTFE מותאמת היטב לתחתית תבנית הזכוכית.

בשלב הבא, בעזרת שפכטל ומשפך גומי סיליקון, העבירו את דייסות חלקיקי המלח לתבנית הזכוכית. לאחר מכן, הקישו בעדינות על התבנית באמצעות השפכטל כדי להבטיח פיזור אחיד של החלקיקים, וגרדו את עודפי המלח. כעת כבו את האינקובטור המחומם והכניסו אליו במהירות את התבניות הממולאות במלח; המלח יתאחה במהלך 30 הדקות הבאות, ולאחר מכן ייבשו את התבניות בתנור ואקום בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות.

ביום למחרת, לאחר הקירור, הוצא את המנדריל מפלדת אל-חלד מהתבניות על ידי דחיפתו החוצה תוך כדי אחזקת טבעת ה-PTFE. במידת הצורך, השתמש בפלייר שפיץ. לאחר מכן, הסר את טבעת ה-PTFE מתחתית התבנית.

בשלב הבא, אפו את התבניות כדי לכווץ את השרוול והוציאו את השרוולים המכווצים מהתבניות. הניחו לתבניות להצטנן עד לשימושן ואחסנו אותן במייבש (desiccator) בתוך מזהם.

בדוק אם תמיסת ה-PGS זורמת במורד דופן התבנית. אם קיים אזור יבש, הוסף PGS נוסף. כעת אפשר ל-THF להתאדות במכסוף למשך 30 דקות לפחות. לאחר שה-THF התאדה, בצע פולימריזציה (cure) לתבניות בתנור ואקום.

לאחר ייבוש למשך יום אחד, קררו את התבניות לטמפרטורת החדר וטבלו אותן לאט, באופן אנכי, במים דה-יוניים בטמפרטורה של 24 °C. הטיה מהירה מדי יוצרת בועות אוויר, אשר קורעות את הפיגום. העבירו בזהירות את התבניות לאמבט המים.

מקם אותם בזווית באמצעות צינור סיליקון, והמתן שעה עד להמסת החומצה ההיאלורונית. אם לאחר שעה החומצה ההיאלורונית לא השתחררה מהתבנית, השתמש בשפכטול כדי לדחוף בעדינות את החומצה ההיאלורונית משני הקצוות בעוד התבנית טבולה, ולאחר מכן נער את התבנית בעדינות. כעת, ודא שהפיגומים (scaffolds) לא זזו בתוך תבנית הזכוכית, ואם כן, משוך את הפיגום באיטיות באמצעות פינצטה כדי לשחררו מהתבנית.

בשלב הבא, יש להמיס את חלקיקי המלח על ידי העברה זהירה של הפיגומים העדינים לאמבט של מים דה-יוניזציה תוך ערבוב עדין. תהליך זה יימשך לפחות שלושה ימים ודורש החלפה יומית של המים. לאחר שכל המלח הומס, העבירו כל פיגום לשפופרת צנטריפוגה של 15 מיליליטר המלאה במים דה-יוניזציה והקפיאו אותם בתיבת קרח יבש למשך שעה. הניחו את שפופרות הצנטריפוגה הקפואות בתוך ליופיליזטור למשך שלושה ימים כאשר הפקקים פתוחים.

לאחר ייבוש בהקפאה, יש לאחסן את הפיגומים במייבש עד למועד השימוש. התחילו בחיתוך הפיגומים לאורכים של 25 עד 30 מילימטר. לאחר מכן, הכינו שני פקקי גומי סיליקון על ידי העברת צינורית PTFE דרך החורים המרכזיים של כל פקק.

לאחר מכן, גזרו קטעים של 1.5 מילימטר של טבעת hs והשחילו קטע אחד לקצה אחד של הפיגום. דחפו צינור PTFE אחד המחובר לפקק אל אותו קצה של הפיגום, עם חפיפה מספיקה כדי להיות תחת טבעת ה-HS, כדי לחבר את הפיגום לצינור בצורה חזקה; כווצו את טבעת ה-HS בתנור והמתינו שהמכלול יתקרר לטמפרטורת החדר. כעת, השחילו מעל הפיגום צינור פוליקרבונט באורך 50 מילימטר, המשמש כתא של הביוראקטור, והדקו אותו לפני השטח הפנימי של פקק גומי הסיליקון.

בדומה לשלב הקודם, צינור PTFE נוסף ופקק מקובעים בקצה השני של הפיגום באמצעות טבעת hs להשלמת התא. הפקק השני מחובר לקצה השני של צינור הפוליקרבונט. לאחר מכן, המשטחים החיצוניים של הפקקים מחוברים לשתי לוחות מסגסוגת אלומיניום.

השחילו שני מוטות הברגה לתוך החור הצדי בכל לוחה והדקו את הלוחות באמצעות ברגי פרפר. חברו את הפיגום לביו-ריאקטור. כעת own מדדו את האורך הנראה של כל פיגום, שהוא המרחק בין שתי טבעות ה-hs, וחשבו את שטחי הפנים הפנימיים שלהם.

לזריעת תאים. בתוך אוטוקלאב, עקרו את התאים, כאשר כל אחד עטוף בנפרד בנייר אלומיניום, יחד עם כל חלק מיחידת הביוריאקטור. לאחר העיקור, הרכיבו את הביוריאקטור בתוך מנף לתרבית תאים.

בצע טיפול מקדים ושטיפה של הפיגום באמצעות סדרה של פרפוזיות, תוך שימוש במשאבה פריסטלטית בקצב של one millimeter per minute במעגל הזרימה. התחל בשטיפה עם 70%ethanol, 50%ethanol, ולאחר מכן 25%ethanol למשך שעה עבור כל אחד מהם. לאחר שלושת השטיפות באתנול, בצע שטיפה ב-PBS למשך שעתיים.

לבסוף, בצעו פרפוזיה לביו-ראקטור עם מצע גידול של SMC למשך 24 שעות, שלאחריהן הוא מוכן להזרעת תאים ולניסוי. כעת, בהתאם להוראות במאמר הנלווה, זרעו בביו-ראקטור 2 מיליון תאים לסנטימטר רבוע, ובמהלך 21 הימים הבאים, החליפו את מצע הגידול בצנרת ובצעו התאמות במהירות המשאבה. באופן הדרגתי, הלחץ במבנה יעלה מכ-4 millimeters mercury ביום הראשון של התרבית למעל 100 millimeters mercury לאחר שבועיים בתרבית; לאחר שלושה שביעות בתרבית, קצרו את התאים והכינו אותם לאנליזה כפי שפורט במאמר הנלווה.

פיגומים צינוריים אלו של PGS יוצרו בשיטת היתוך מלח. מיקרוגרפים של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק הדגימו כי לכל הפיגומים היה עובי דופן הומוגני ולא נצפו פגמים חלקיים בחתכי הרוחב שלהם. נקבים מאקרוסקופיים ומיקרוסקופיים המפוזרים באופן אקראי נצפו על פני השטח הלומינליים של כל הפיגומים.

לאחר תרבית התאים, תאי SMC רב-שכבתיים צמחו בכיוון ניצב לכיוון הזרימה. יתרה מכך, התאים וחלבוני ה-DCM כיסו לחלוטין את הלומן של כל מבני ה-PGS. אוטופלואורסצנציה של אלסטין הראתה גם סיבי אלסטין מאורגנים היקפית על פני השטח הלומנלי של המבנה.

לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להבין כיצד להכין פיגום צינורי נקבובי, כיצד לצפות בתאים ולהרבות את הפיגום באמצעות ביו-ראקטור שתוכנן מראש.