קביעת מיטוכונדריאלי המינים ממברנה פוטנציאליים הריאקטיבי חמצן בנוירונים חולדה חיה קליפתיים
23 במאי 2011
אנו מדגימים יישום מחוון פלואורסצנטי, TMRM, ב נוירונים בקליפת המוח כדי לקבוע את השינויים יחסית בעוצמת הקרינה TMRM לפני ואחרי יישום של גירוי מסוים. אנחנו גם מראים יישום בדיקה הקרינה H 2 DCF-DA להעריך את הרמה היחסית של מינים החמצן מגיב על נוירונים בקליפת המוח.
מטרת פרוצדורה זו היא לקבוע את פוטנציאל ממבנה המיטוכונדריה ואת רמות רדיקלי החמצן בנורונים קורטיקליים ראשוניים, תוך שימוש בח probes הפלואורסצנטיים TMRM ו-H 2D CFD בהתאמה. דבר זה משיג תחילה על ידי הכנת תמיסות סטוק וריכוזי עבודה של TMRM ו-H 2D CFDA. השלב השני הוא דגירה של הנורונים הקורטיקליים עם TMRM ו-H 2D CFDA בטמפר Thai roads בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
השלב השלישי הוא הדמיית עוצמת הפלואורסצנציה של TMRM ו-DCF בנוירונים קורטיקליים חיים באמצעות עירור ופליטה של 515/517 ננומטר ו-488/515 ננומטר בהתאמה. השינויים בפלואורסצנציה של TMRM ינוטרו בנוכחות ה-uncoupler המיטוכונדריאלי FCCP, בעוד שהשינויים בפלואורסצנציה של DCF ינוטרו בנוכחות מימן פרוקסיד. השלב הסופי של פרוצדורה זו הוא איסוף הנתונים, נורמליזציה וניתוח שלהם.
בסופו של דבר, התוצאות מתקבלות על ידי שרטוט גרף המציג את הרמות היחסיות של עוצמת הפלואורסצנציה של TMRM ו-DCF לפני ואחרי טיפול ב-FCCP ובמימן פרוקסיד, בהתאמה. שלום, אני ג'ואנה קוסקה. ברוכים הבאים למעבדה שלי באוניברסיטת לויולה בשיקגו.
היום נראה לכם כיצד למדוד פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי ומינים חמצוניים ריאקטיביים בנוירונים קורטיקליים של חולדה. הפרוצדורה תודגם על ידי dhi. שלום, אני דניס ג'וסי.
באמצעות פרוצדורה זו, ניתן למדוד את הפוטנציאל של ממברנת המיטוכונדריה בסימון של מיטוכונדריה בודדת, ואת רמות רדיקלי החמצן (ROS) בסימון של תא בודד. אם כן, נתחיל. הכינו תמיסת סטוק של TMRM בריכוז 10 millimolar על ידי המסה של five milligrams של TMRM ב-one milliliter של dimethyl sulf oxide אנहाइडרי, וערבבו ב-vortex למשך דקה אחת.
לאחר מכן, הכינו מנות (aliquots) ואחסנו אותן בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. יש להגן מהאור ולהשתמש תוך חודש אחד. בשלב הבא, הכינו תמיסת מלאי (stock) של H 2D CFDA בריכוז 10 millimolar על ידי המסה של 4.87 milligrams של H 2D CFDA בתוך one milliliter של dimethyl sulf oxide ללא מים (anhydrous).
באופן דומה, ערבבו במערבל Vortex למשך דקה אחת, לאחר מכן חלקו למנות (aliquots) ואחסנו אותן במינוס 20 מעלות צלזיוס. הגנו מהאור והשתמשו בתוך שבוע כדי להטעין תחילה את נוירוני קליפת המוח של החולדה ב-TMRM. שטפו את הנוירונים המטופחים שלוש פעמים עם בופר טיירו (tyro's buffer).
לאחר מכן, הכין TMRM בריכוז 20 nano molar על ידי דילול של מלאי TMRM בריכוז 10 millimolar פי 1000 ב-tb. לאחר מכן, הוסף שני microliters של TMRM מדולל לכל milliliter אחד של tb. דגרי את הנוירונים עם TMRM למשך 45 דקות בחושך ובטמפרטורת החדר.
לאחר 45 דקות, מקמו את צלחת התרבית עלבמת המיקרוסקופ והתחילו בדימות כדי להטעין את נוירוני קורטקס החולדה ב-H 2D CFDA, ושטפו את הנוירונים בתרבית שלוש פעמים ב-tb. לאחר מכן, הכינו תמיסת H 2D CFDA בריכוז 2 µM על ידי דילול של תמיסת הסטוק של H 2D CFDA בריכוז 10 mM פי 10 ב-tb. לאחר מכן, הוסיפו 2 µL של H 2D CFDA מדולל לכל 1 mL של tb.
לאחר מכן, דגרו את הנוירונים עם H 2D CFDA למשך 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. שטפו את הנוירונים ארבע פעמים עם TB כדי להסיר את עודפי האינדיקטור הפלואורסצנטי לפני קבלת התמונות לביצוע הדמיה חיה של נוירונים שדגרו עם TMRM באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקת לייזר, תוך שימוש בתוכנית לסדרות זמן חיות (live time series program). השתמשו ברזולוציה נמוכה ובעוצמת לייזר מוחלשת כדי למזער את הזמן הנדרש לקבלת התמונות וכדי למנוע פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching).
בשלב הבא, כווננו את המיקוד של הנוירונים המותקנים והטעונים ב-TMRM באמצעות אור מוחזר. בחנו את הפלואורסצנציה של ה-TMRM על ידי הארה ב-540 ננומטר וגילוי ב-570 ננומטר. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, הכוללים רזולוציה, עוצמת לייזר, הגבר של המצלמה ומרווחי זמן לצילום (time-lapse), הגדירו את הגבר הגילוי של המצלמה לרמה הנמוכה ביותר מרף הרוויה.
אין לשנות הגדרות אלו בין ניסויים. לאחר מכן, שנו את השדה. התחילו באיסוף תמונות כדי לבחון שינויים בגירוי ה-delta PSY M; ניתן להשתמש, למשל, ב-1 µM של FCCP או ב-2 µg/mL של oligomycin, אשר יגרמו לדה-פולריזציה או להיפר-פולריזציה משמעותית של פוטנציאל ממברנה המיטוכונדריאלית, בהתאמה.
שינויים אלה יבואו לידי ביטוי בירידה בעוצמת הפלואורסצנציה של TMRM בהשוואה לעוצמת הפלואורסצנציה הבסיסית במקרה של FCCP, או בעלייה בעוצמת הפלואורסצנציה של TMRM. במקרה של LIGA myin sin לצורך ביצוע דימוי חי של נוירונים שהודגרו עם H 2D CFDA, ראשית מקבעו את צלחת התרבית עלבמתו של המיקרוסקופ, והתאימו את המיקוד של התאים באמצעות אור מוחזר. בחנו את פלואורסצנציית ה-DCF על ידי עירור ב-4 88 nanometers ופליטה ב-five 15 nanometers.
בשלב הבא, כוון את עוצמת הלייזר ל-5% עד 7%, הגדר הגבר (gain) ורזולוציה של 256 על ידי 256. אין לשנות הגדרות אלו בין ניסויים. לאחר מכן, הגדר את התדירות לקבלת תמונות חיות.
בעזרת תוכנית סדרות הזמן (Time series), בחרו שדה חדש והתחילו ברכישת תמונות כדי לזהות שינויים ברמות ה-R os. טפלו בתאים ב-100 עד 200 micromolar של מי חמצן. הדבר יבוא לידי ביטוי בעלייה בעוצמת הפלואורסצנציה של DCF בהשוואה לרמת הבסיס.
השתמש בכלי הגדרת אזור העניין (region of interest) מתוכנת ה-LSM כדי לבחור את האזורים. לאחר מכן, בחר ROIs מאזורי מיטוכונדריה או ROIs מכל גוף התא בתאי הדמיя. זאת כדי למדוד את עצימיות הפלואורסצנציה של TMRM או ROS, בהתאמה.
בחרו אזורים סמוכים לתאים. כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנציה של הרקע, בצעו מספר מדידות; כדי לחשב את עוצמת הרקע הממוצעת, הפחיתו את עוצמת פלואורסצנציית הרקע הממוצעת מעוצמות הפלואורסצנציה הממוצעות של אזורי העניין בכל תא עבור כל נקודת זמן באמצעות Microsoft Excel. לאחר הפחתת עוצמת הרקע, נרמלו את עוצמת הפלואורסצנציה של TMRM או DCF ביחס לפלואורסצנציית הבסיס.
השתמשו בנוסחה זו, ולאחר מכן השתמשו בתוכנת Sigma plot כדי להפיק את הגרף המראה את השינויים בעוצמת הפלואורסצנציה לאורך זמן. להלן דוגמה לתמונת פלואורסצנציה של נוירונים קורטיקליים של חולדה שהודגרו עם TMRM. הוספת המפקיע המיטוכונדריאלי F-C-C-P-A מובילה לדפולריזציה מיטוכונדריאלית ולאובדן של עוצמת הפלואורסצנציה של TMRM.
רמת הפלואורסצנציה הבסיסית של TMRM נותרת יציבה לפני הוספת FCCP. ניתוח כמותי של שינויים בפלואורסצנציית TMRM לאורך זמן מראה ירידה משמעותית בפלואורסצנציית TMRM לאחר הוספת FCCP. להלן דוגמה לתמונת פלואורסצנציה של נוירונים קורטיקליים של חולדה שנטענו ב-DCF.
רמת הפלואורסצנציה הבסיסית של DCF נשארת ללא שינוי ב-120 השניות הראשונות לפני הוספת מי חמצן. הוספת מי חמצן מובילה לעלייה בעוצמת הפלואורסצנציה של DCF בגופי התאים. מדידות Time-lapse של פלואורסצנציית DCF מראות רמות יציבות שעלו לאחר טיפולים במי חמצן.
בנוהל זה, חשוב לזכור להשתמש בהספק לייזר נמוך ובמהירות סריקה גבוהה כדי למנוע ארטיפקטים של דהייה פוטוכימית (photo bleaching) ורעילות פוטוית (phototoxicity). בהצלחה בניסוי שלכם.
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את השימוש באינדיקטורים פלואורסצנטיים TMRM ו-H2D CFDA להערכת פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה ורמות של מיני חמצן רבטיביים בנוירונים קורטיקליים. המתודולוגיה כוללת דימוי של שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה בתגובה לגירויים ספציפיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- דימוי פלואורסצנטי
רקע
- פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי הוא קריטי לתפקוד הנוירונים.
- רדיקלים חופשיים של חמצן (ROS) ממלאים תפקיד באיתות תאי ובתגובות למעקה.
- גששים פלואורסצנטיים מאפשרים ניטור בזמן אמת של תהליכים תאיים.
- הבנת הדינמיקה הזו יכולה לספק מידע למחקר נוירוביולוגי.
מטרת המחקר
- למדידת פוטנציאל ממבנה המיטוכונדריה בנוירונים קורטיקליים.
- להערכת רמות של מיני חמצן רבטיביים באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים.
- להערכת ההשפעות של גירוים ספציפיים על פרמטרים אלה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיססות מרוכזות של TMRM ו-H2D CFDA.
- אינקובציה של נוירונים קורטיקליים עם גששים פלואורסצנטיים.
- דימות חי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לניטור עוצמת הפלואורסצנציה.
- ניתוח נתונים לכימות שינויים בפלואורסצנציה לפני ואחרי טיפולים.
תוצאים עיקריים
- שינויים בפלואורסצנציה של TMRM מעידים על שינויים בפוטנציאל ממבנה המיטוכונדריה.
- עלייה בפלואורסצנציה של DCF משקפת רמות מוגברות של מיני חמצן ריאקטיביים.
- גירויים ספציפיים כגון FCCP ומימן פחמון משפיעים באופן משמעותי על עוצמת הפלואורסצנציה.
- התוצאות מספקות תובנות לגבי תפקוד מיטוכונדריאלי ועקה חמצונית בנוירונים.
מסקנות
- המחקר מדגים בהצלחה את היישום של גששים פלואורסצנטיים בנוירונים חיים.
- הממצאים תורמים להבנת הדינמיקה המיטוכונדריאלית והסטרס החמצוני בנוירונים קורטיקליים.
- ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי לחקור תהליכים נוירוביולוגיים נוספים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה כמותית של פוטנציאל ממבנה המיטוכונדריה ושל מיני חמצן רבטיביים בנוירונים חיים מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית בשלב הגילוי המוקדם. מדידות אלו מספקות ביטחון חיזוי עבור תיקוף מטרות ובחינת מסלולים במודלים של ניוון עצבי ומצבי עקה תאית. שילוב של מדדים אלו תומך בקבלת החלטות מותאמות סיכון עבור פורטפוליו המחקר ובהמשכיות תרגומית משלב הגילוי למחקר פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה ומסלולי עקה חמצונית במערכות נוירונליות הרלוונטיות למחלה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי כימות דה-פולריזציה מיטוכונדריאלית והצטברות ROS בתגובה לגירויים מוגדרים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור פנוטיפים תאיים להפרעות ספציפיות.
- משפר את הביטחון הניבוי עבור קידום מטרות של ניוון עצבי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקיים בדיקות פלורוצנציה מתוקתקות למדידת תפקודי מיטוכונדריה ועקה חמצונית בנוירונים ראשוניים.
- מספק תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור המתאימות לסריקת תרכובות ולמחקרים של מודולציה של מסלולים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה ופרוטוקולי נורמליזציה לצורך השוואה בין מחקרים.
- מכין פלטפורמות חסונות לסריקות המשך ולהערכה מכניסטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר מדדי תאיים למנגנונים הרלוונטיים למחלה המעורבים בניוון עצבי ובתפקוד מטבולי לקוי.
- תומך ברציפות משלב הגילוי in vitro ועד לתיקוף במודל פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות למדידות השוואתיות של מיטוכונדריה ו-ROS.
- מספק בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על ביומרקרים תפקודיים כמותיים.
- מספק נקודות קצה מכניסטיות לפיתוח ביומרקרים תרגומיים, כאשר הדבר נתמך על ידי מחקרים נוספים.
אינטגרציית צינור עיבוד וזרימת עבודה
שיטה זו, המבוססת על פלואורסצנציה, משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת קריאות כמותיות ומכניסטיות במערכות עצביות חיות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי מדידת דה-פולריזציה מיטוכונדריאלית ושינויים ב-ROS לאחר הפרעות מוגדרות.
- סריקה: מספק פלטי פלואורסצנציה הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה עבור סריקה של תרכובות או סריקה גנטית בנוירונים ראשוניים.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות ונורמליזציה של עוצמת הפלואורסצנציה לצורך השוואה סטטיסטית חזקה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים in vitro למודלים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות למדידה עקבית של נקודות קצה של סטרס מיטוכונדרי וחמצוני.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר ולהתאמה לסוגי תאים ואזורי מוח מגוונים עם שינויים מינוריים בפרוטוקול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים בביולוגיה של מערכת העצבים בשלבים מוקדמים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות מבוססות פלואורסצנציה לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין צוותי גילוי.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ומיון יעיל של תיק הפרויקטים על בסיס נתונים תפקודיים כמותיים.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות למחקר ניוון עצבי ותפקוד לקוי של מיטוכונדריה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדימות פלואורסצנציה של תאים חיים ובניתוח נתונים כמותי.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה קונפוקלית עם מסנני עירור/פליטה מתאימים ותוכנה לניתוח תמונות.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים של פרמטרי הדימות ופרוטוקולי נורמליזציה.
- ניתן להתאימה לסוגי נוירונים ומודלי תאים שונים באמצעות שינויים קלים.
- יש למזער הבהרה פוטוית (Photo bleaching) ורעילות פוטוית כדי להבטיח את שלמות הנתונים.
שאלות נפוצות על ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:46
Introduction
2:23
Preparing the Stock Solutions for the Fluorescent Probes TMRM and H2DCF-DA
3:15
Loading Rat Cortical Neurons with TMRM and H2DCF-DA
4:42
Live Imaging of Neurons Incubated with TMRM to determine ΔΨm
6:17
Live Imaging of Neurons Incubated with H2DCF-DA to Determine ROS
7:18
Data Analysis
8:22
Representative Results: Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons
9:33
Conclusion
