פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ"א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאפשר הקמה אוטומטית, מהירה ואמינה של מערכים המבוססים על QPCR. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת סטים של פריימרים עבור המערך והכנת תערובות מאסטר (master mixes) של הדגימות לסריקה. לאחר מכן, נעשה שימוש בהקמה רובוטית אוטומטית של PCR או במערכת פפיטות אלקטרונית מטריצית כדי להעביר במדויק את תערובת המאסטר של הדגימה ואת סטי הפריימרים לכל באער של פלטה בעלת 384 באערים.

לאחר ההכנה, תגובות ה-PCR בלוח של 384 בארות מורצות באמצעות תוכנית PCR של light cycler four 80 cyber. השלב הסופי של הפרוטוקול הוא ניתוח נתוני ה-QPCR וקביעת רמות הביטוי היחסיות עבור כל זוג פריימרים שנבדק, כאשר כל זוג מהם מכוון ל-mRNA ספציפי. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות שינויים בביטוי של קבוצות גדולות של mRNAs.

לפיכך, מערכים שפותחו באופן ספציפי יכולים להתמקד בפרופילים שלמים של pre-microRNA, במסלולים ספציפיים או במולקולות המהוות מפתח לזיהום נגיפי באמצעות פרופיל מבוסס qPCR. שלום, אני Dirk DMA מהמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'פלהיל. היום נראה לכם כיצד להגדיר qPCR בזמן אמת, ונציג בפניכם שתי שיטות.

אחד, באמצעות פיפטה ידנית ואחד באמצעות רובוט. אנו משתמשים בטכנולוגיה זו למדידת pre-microRNAs ו-microRNAs בוגרים בגידולי אדם. ההדגמה היום תבוצע על ידי Pauline Chu ו-Kristen bu.

אם כן, נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, הוציאו פלטות פריימרים המכילות 186 זוגות פריימרים בפורמט של 96 בארות בריכוז 0.5 picaMoles, המאוחסנות בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius.

לאחר הפשרת הפלטות בטמפרטורת החדר, ערבבו אותן ב-vortex וסובבו אותן בקצרה בצנטריפוגה. כמו כן, הפשירו את תערובת ה-cyber green two times PCR mix בטמפרטורת החדר; להקמה של כל פלטת פריימרים בעלת 96 בארות, יידרשו ארבעה מבחנות master mix. הכינו את ה-master mix על ידי שילוב של 4 µL מתערובת ה-cyber green, 3 µL של מים בדרגת PCR ו-10 עד 20 ng של DNA של הדגימה או cDNA לכל תגובה, בכל אחת מארבע מבחנות Eppendorf בנפח 2 mL.

כל מבחנה צריכה להכיל תערובת מאסטר (master mix) מספקת לכ-100 תגובות, כולל כמות עודפת לפיצוי על איבוד במהלך הפיפטור. ערבבו את מבחנות ה-einor באמצעות וורטקס (Vortex). התחילו בהכנה של בדיקת ה-micro RNA המקדים (precursor micro RNA assay) באמצעות רובוט ה-freedom Tecan EVO, כולל אתחול הרובוט וטעינת תוכנית ה-EVO wear.

לאחר מכן, שטפו את הרובוט שלוש פעמים עם 30 milliliters של נוזל מערכת כדי לנקות את המערכת מבועות אוויר שיפריעו לדיוק השפיפה. לאחר מכן, הגדירו את פלטפורמת הרובוט כך שתכלול פלטה של 384 בארות ופלטת פריימר של 96 בארות. התערובות הראשיות (master mixes) כוללות תעלה המכילה 2% bleach, מיכל נוזלי מערכת מלא ומיכל פסולת ריק.

התחילו את ההרצה האוטומטית של הרובוט על ידי בחירה ב-run פעמיים בסיום התוכנית. הוציאו את פלטת ה-384 בארות ואטמו אותה באמצעות רדיד אלומיניום מסוג light cycler four 80 ceiling foil. לאחר מכן, סובבו את הפלטה בצנטריפוגה.

הנח בקצרה את פלטת 384 הבארות האטומה בעמדה אחת של ה-hotel. לאחר מכן, חזור על תהליך זה עבור פלטת הפריימר השנייה עם תערובות מאסטר (master mixes) חדשות ופלטת 384 בארות חדשה. הנח את פלטת 384 הבארות האטומה שהתקבלה בעמדה שתיים של ה-hotel.

פתחו תוכנית EVO wear חדשה עבור טעינת מחזור אור (light cycler) מהמלון והגדירו את פרמטרי המחזור. לאחר מכן בחרו בהרצה פעמיים. ה-Freedom Evo יטען אוטומטית כל פלטה אל מחזור האור ויריץ את תוכנית מחזור ה-HRM של cyber green.

עם סיום הפעולה, יש לסקור ולנתח את התוצאות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב כחלופה לשימוש ברובוט. ניתן להשתמש בפיפט רב-ערוצי למטריצות כדי להעביר את תכולת מבחנת התערובת הראשית (master mix) אל תוך מיכל (reservoir).

כוון את הפ pipette האלקטרונית לשאוב 16 µL של תערובת מאסטר (master mix) עם שני שלבי פליטה של 8 µL ואחריהם שלב ניקוז (purge). לאחר הגדרת הפ pipette, שאב 16 µL של תערובת מאסטר והתחל להעביר אותה לתוך פלטת 384 עם גלגל. פלוט את 8 µL הראשונים לכל שורה שנייה בעמודה אחת, בשורות A עד O, והשאר את העמודה הבאה ריקה.

העבירו את שמונת המיקרוליטרים השניים לאותן שורות בעמודה שלוש. לאחר מכן, בצעו שטיפה (purge) מעל מיכל פסולת והשליכו את הטיפים, תוך המשך דפוס זה של השארת שורות ועמודות לסירוגין. חזרו על הפעולה ברחבי הפלטה למשך חמישה מחזורים נוספים עבור תערובת מאסטר 2.

השתמש באותן שורות כמו בתערובת המאסטר הראשונה, אך התחל מעמודה שתיים. חזור על הליך זה עבור תערובות המאסטר השלישית והרביעית, תוך התחלה מעמודות אחת ושתיים בהתאמה, אך הפעם השתמש בשורות B עד P של פלטת הפריימרים. כוון פפיטה אלקטרונית לשאיבה של 2 µL והזרקה של 2 µL, ולאחריה שלב שטיפה (purge).

העבירו 2 µL של פריימרים מעמודה אחת, שורות A עד H, של פלטת פריימרים בעלת 96 בארות, לכל שורה שנייה בעמודה אחת של פלטה בעלת 384 בארות; בצעו שטיפה מעל מכל פסולת והשליכו את הטיפים. חזרו על תבנית זו עבור פריימר quatt עבור שלושת תערובות המאסטר (master mixes) הנותרות בעמודות אחת ושתיים. לאחר מכן, המשיכו בתהליך זה עבור עמודות 2 עד 12 של פלטת הפריימרים בעלת 96 הבארות, תוך מעבר של כל שתי עמודות בפלטה בעלת 384 הבארות עבור כל עמודת פריימר.

בשלב הבא, אטמו את הפלטות עם מכסה למחזור אור, נייר אלומיניום וסבבו בצנטריפוגה. מיד לאחר הצנטריפוגה, הכניסו את הפלטות למחזור אור four 80 והפעילו את הפלטות באמצעות פורמט גילוי HRM של cyber green one.

תוך שימוש באותם תנאי מחזור כפי שבוצעו קודם לכן, חזור על הליך זה באמצעות לוח הפריימרים השני Eloqua לתוך לוח 384 בארות חדש, תוך שימוש בתערובות מאסטר (master mixes) שהוכנו acabado. חתימות של micro RNA מקדימות עולות מתוך פרופיל באמצעות מערך חדש המבוסס על QPCR. חישוב ה-delta CT הממוצע כפי שנורמל ל-U six בוצע, וערכים סטנדרטיים הועמסו לתוך המערך.

תוכנה מסוג Minor המניבה שלושה אשכולות נפרדים המוצגים כמפות חום. הביטוי היחסי של כל precursor micro RNA מוצג בצבעים, כאשר אדום וכחול מייצגים עלייה וירידה בביטוי היחסי, בהתאמה. עוצמת הצבע מעידה על מידת השינוי בביטוי.

מרבית ה-microRNAs הקדמוניים עברו שינויים קטנים ובלתי משמעותיים כצפוי. עם זאת, חלק קטן מה-microRNAs הקדמוניים עלו באופן משמעותי לאורך הניסוי בנקודות הזמן השונות. בנוסף, הרמה היחסית של חלק מה-microRNAs הקדמוניים ירדה באופן דרמטי.

במקרים מסוימים, הם מתקבצים יחד גם בניתוח מפת החום (heat map). בהתאם לניסוי, עשויים להיווצר אשכולות התלויים בזיהום נגיפי, בביטוי ספציפי לסוג התא של precursor microRNAs, או ב-precursor microRNAs המווסתים על ידי מולקולה משותפת או מסלול איתות.

מוצגים ספי ciclos thresholds הממוצעים או ה-cts מדגימה שלילית לנגיס ההרפס הקשור לסרטן קפושי, שהורצה בארבעה כפילויות. חשוב לציין כי לא זוהה בתוך דגימה זו ה-Kaposi's sarcoma associated herpes virus latency associated nuclear antigen או KSHV Lana באמצעות מערך ה-QPCR בעל הרגישות הגבוהה. עם זאת, הן בקרת הפנים U six והן let seven a, שבלחלוף הוא precursor micro RNA אנושי בעל ביטוי גבוה, התבטאו ברמות שניתן לזהותן.

לבסוף, כצפוי, בקרת השלילה של מים בדרגת PCR לא הניבה תוצר A-Q-P-C-R. מוצג ניתוח עקומת המסחה עבור שני פריימרים שונים, תוך שימוש באותה כפילות דגימה.

ניכר כי טמפרטורת ההמסה שונה עבור שני זוגות הפריימרים, אך הדגימה נמסה בדיוק באותה טמפרטורה עבור כל שכפול. סימנים לדגימה פגומה או מזוהמת פוטנציאלית עשויים לכלול מספר שיאי המסה המרמזים על נוכחותם של שני מקורות קלט שונים. הרגע הדגמנו כיצד להקים ניסויי QPCR בזמן אמת באמצעות רובוט.

חשוב לכלול את כל הביקורות וכמה שיותר גנים של ביתי-משק (housekeeping genes). תודה שצפיתם בה, ובהצלחה בניסוייכם.