, טיהור הכנה, אפיון של מכלולים Lanthanide לשימוש בתור סוכנים בניגוד עבור דימות תהודה מגנטית

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לסנתז, לטהר ולאפיין קומפלקסים המכילים לנתניד, אשר יכולים לשמש לסימון של מקרו-מולקולות ביולוגיות. דבר זה מושג תחילה על ידי ערבוב של חומר המוצא המתכתי והליגנד תוך בקרה על ה-pH של התמיסה. השלב השני של הפרוצדורה הוא טיהור הקומפלקס שהתקבל באמצעות דיאליזה.

בשלב הבא, יש לוודא את היעדרם של מתכות חופשיות. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא אפיון התכונות של הקומפלקס הרלוונטיות לדימות. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי הקומפלקסים המסנתזים יתנהגו כחומרי ניגוד באמצעות מדידות פעילות רלקסציה.

שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מרכזיות בתחום הדימות, כגון השאלה האם מספר הקואורדינציה של המים בחומר ניגוד משתנה בעת קישור לחלבון. באופן כללי, אנשים הזקוקים לשיטה זו יתקלו בקשיים, שכן שליטה מדויקת ב-pH תגרום להפיכת ה-LI לבלתי שמיש עבור חינוך ביולוגי. הדגמת הדיאליזה ומדידות הפעילות יבוצעו על ידי Buda ו-Sashi.

סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל את התהליך באמצעות מלחים של לנתנידים, ראשית המיסו שווה ערך אחד של ליגנד במים כדי להכין תמיסה בריכוז של 30 עד 265 millimolar. הליגנד Paraiso Benzyl DTPA משמש כאן בריכוז של 73 Millimolar. לאחר מכן, כוונו את ה-pH של תמיסת הליגנד לערך שבין 5.5 ל-7 על ידי הוספת ammonium hydroxide בריכוז של 1 molar.

בסרטון זה, נעשה שימוש ב-0.2 milliliters של תמיסת ammonium hydroxide בריכוז one molar כדי להמיס כעת מקבילים (equivalents) אחד עד שניים של lanthanide chloride במים, במטרה להפיק תמיסה בריכוז של 5 עד 1000 millimolar. ניתן להשתמש ב-euro bium chloride או ב-gadolinium chloride בריכוזים של 111 millimolar. לעיתים קרובות נעשה שימוש בעודף של מתכת כדי להביא את תהליך ה-ventilation לסיום, ובכך לפשט את תהליך הניקוי.

בשלב הבא, הוסיפו כל תמיסה של מלחים של לנתניום לתמיסת הליגנד שהוכנה תוך כדי ערבוב. כעת, כווןו את ה-pH של תערובות התגובה שהתקבלו לערך שבין 5.5 לשבעה על ידי הוספת own-ammonium hydroxide בריכוז 0.2 molar. בשלב זה, נעשה שימוש בנפח כולל של 0.5 milliliters של תמיסת ammonium hydroxide בריכוז 0.2 molar כדי לכוון את התמיסה.

אם הליגנד שבשימוש מכיל קבוצות פונקציונליות הרגישות לחומצה, יש להתאים את ה-pH מספר פעמים במהלך שלב זה. יש לנהוג בזהירות בעת התאמת ה-pH, כיוון שאם התמיסה תהפוך לבסיסית מדי, קבוצות פונקציונליות הרגישות לבסיס, כגון Isothiocyanate, יהפכו לבלתי שמישות. לצורך הצמדה (conjugation), יש לעקוב מקרוב אחר התגובה באמצעות מדידות pH.

התגובה הושלמה כאשר ה-pH נשאר קבוע. עבור ליגנדים ללא קבוצות פונקציונליות הרגישות לבסיס, עיבוד הכולל העלאה של ה-pH עשוי להיות מועיל גם הוא. כדי להתחיל את עיבוד הדיאליזה, קבעו אורך מתאים של צינור דיאליזה שיכיל את נפח הדגימה בתוספת אורך נוסף להכלה של 10% נוספים מנפח הדגימה. לאחר מכן, פעלו לפי הנחיות היצרן כדי לחתוך את הצינור לאורך זה.

בסרטון זה נעשה שימוש בממברנה עם סף חיתוך של משקל מולקולרי של 100 עד 500 Dalton, אך ניתן להשתמש בצינורות עם סף חיתוך של משקל מולקולרי גבוה יותר לפי הצורך. אם הצמדה (conjugation) מבוצעת לפני המתיזציה (methation), ואם הדבר מתאים בהתאם להנחיות היצרן, יש להשרות את צינור הדיאליזה החתוך במים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מלאו מיכל דיאליזה במים, אשר ישמשו כתמיסת הדיאליזה. במקרה זה נעשה שימוש בכוס כימית בנפח של one liter.

נפח התמיסה לדיאליזה צריך להיות גדול פי 100 בערך מנפח הדגימה. כעת קפלו את אחד מקצוות הפיתול פעמיים והדקו את החלק המקופל באמצעות תפס סגירה לדיאליזה. מלפו את קצה הסגירה בגומייה כדי להבטיח שהוא יישאר סגור במהלך הדיאליזה.

סננו את תערובת התגובה שהוכנה קודם לכן דרך מסנן של 0.2 מיקרון. לאחר מכן, העבירו את התסנין אל הקצה הפתוח של הפרוכת, תוך הקפדה שלא לקרוע את הפרוכת.

הקפידו להשאיר מספיק מרווח פתוח כדי לסגור את הפיתול. קפלו את הקצה הפתוח שנותר של הפיתול פעמיים, לאחר מכן אבטחו אותו באמצעות סגירה ועטפו את הסגירה בגומייה. לאחר מכן, הצמידו מבחנה מזכוכית המכילה אוויר לתפסנית בקצה אחד של פיתול הדיאליזה באמצעות גומייה נוספת.

לאחר מכן, חברו מבחנה המכילה חול לתפסן השני. מבחנות אלו מבטיחות שהצינורית תישאר טבולה בתמיסת הדיאליזה. כעת, הניחו את הצינורית המלאה במיכל הדיאליזה המכיל את תמיסת הדיאליזה.

ערבבו את תמיסת הדיאליזה באמצעות בוחש מגנטי במהירות נמוכה בטמפרטורת החדר. ודאו כי מהירות הערבוב נשארת נמוכה וכי התמינה אינה עוברת Vortex. החליפו את תמיסת הדיאליזה שלוש פעמים במהלך היממה.

בסרטון זה, התמיסה הדיאליטית מוחלפת בשעות 2.5, 6.5 ו-11.5. יש לאפשר לדיאליזה להימשך במהלך הלילה למשך זמן כולל של 20 עד 28 שעות. עם השלמת הדיאליזה, הוציאו את הצינור מהתמיסה הדיאליטית ופתחו בזהירות את אחד הסגורים כדי להוציא את הדגימה.

שטפו את צינור הדיאליזה שלוש פעמים במים ואחדו את מי השטיפה עם הדגימה. לבסוף, הסירו את המים מהדגימה תחת לחץ מופחת. פעולה זו תתבצע באמצעות ייבוש בהקפאה.

את הדגימה מקפיאים ולאחר מכן מניחים אותה במכשיר לייבוש בהקפאה. כדי להעריך את נוכחותו של מתכת חופשית בדגימה, הכין תחילה בופר אצטט על ידי המסת 1.4 milliliters של חומצה אצטית ב-400 milliliters של מים, כוונן את ה-pH ל-5.8 באמצעות ammonium hydroxide בריכוז one molar, והוסף מים עד להגעה לנפח כולל של 500 milliliters. לאחר מכן, המס 0.3 milligrams של כל קומפלקס ב-0.3 milliliters של בופר.

כעת הכינו אינדיקטור xol orange, שריכוזו צריך להיות 16 micromolar בבופר pH 5.8. הוסיפו שלושה מיליליטרים של תמיסת אינדיקטור זו לקומפלקסים המתכתיים שהומסו קודם לכן. גלו את נוכחותם של מתכות חופשיות על ידי צפייה בשינוי צבע של האינדיקטור מצהוב לסגול.

במידת הצורך, ניתן לכמת את כמות המתכת החופשית על ידי יצירת עקומת כיול. אם נותרה מתכת חופשית, יש לטהר את הדגימה באופן נוסף באמצעות דיאליזה או כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים (HPLC) לפני האפיון. לאחר מכן, כדי לקבוע את מספר קואורדינציית המים עבור דגימת opium, הכין תמיסה של כ-1 millimolar של הקומפלקס המכיל opium במים, ולאחר מכן תמיסה נוספת באותו ריכוז ב-deuterium oxide.

לפני הניתוח, יש לאדות את תמיסת הדאוטריום אוקסיד ולהמיס אותה שוב בדאוטריום אוקסיד שלוש פעמים כדי להסיר שאריות מים; הפעל את הספקטרו-פלואורימטר, הוסף את תמיסת המים לכובית נקייה והנח את הכובית בתוך הספקטרו-פלואורימטר. כעת בצע עירור ופליטה כדי לקבוע את המקסימום עבור כל אחד מהם, בערכים של כ-395 nanometers ו-595 nanometers בהתאמה. לאחר מכן, בצע ניסוי של דעיכת זמן פוספורסנציה באמצעות אורכי הגל של העירור והפליטה שנקבעו כעת והפרמטרים המוצגים כאן.

חזרו על שלב זה עם תמיסת דאוטריום אוקסיד שהוכנה; מהנתוני דעיכת הפלורסצנציה שהתקבלו זה עתה, שרטטו את הלוגריתם הטבעי של העוצמה מול הזמן. השיפוע של קווים אלה מייצג את קצבי הדעיכה. בסרטון זה, נעשה שימוש ב-Microsoft Excel 2007 כדי להפיק את גרפי הלוגריתם הטבעי מהנתונים הגולמיים.

השתמשו בקצבי הדעי במשוואה שפותחה על ידי hors ועמיתיו, המופיעה כאן. אם הליגנד שלכם מכיל קבוצות OH או NH המתואמות למתכת, יש לשנות את המשוואה לפני השימוש. כדי לקבוע את מדידות היחסיות של הדגימה, בחרו תחילה את מצב היישום הרצוי באנלייזר זמן הרפיה (relaxation time analyzer), T1 או T2.

כאן, נבחרה הגדרת T one. לאחר מכן, הכין סדרה של דגימות המכילות ריכוזים שונים של הקומפלקס המכיל לנתניד בממס מימי. כאן, נעשה שימוש במים כממס ובתמיסות של 10, 5, 2, 0.5, 1.25, 0.625 ואפס.

מכינים תמיסות בריכוז מילימולרי. ניתן להשתמש בממסים או בתחתימי pH (בופרים) מתאימים אחרים, אך חשוב להשתמש בממס כדגימת רקע (blank). הנפח הסופי של הדגימה תלוי במכשיר שבו נעשה שימוש.

הניחו דגימה במכשיר והמתינו חמש דקות להגעה לשיווי משקל עם טמפרטורת המכשיר, שהיא 37 °C עבור היחידה המשמשת בסרטון זה. כעת קבעו את זמן הרלקסציה ביחידות של שניות על ידי התאמת פרמטרי התוכנה כדי לקבל עקומה מעריכית חלקה עבור T one או T two. חזרו על פעולה זו עבור כל הדגימות, כולל דגימת הביקורת (blank).

כעת, חשבו את ההופכי של ערכי ההרפיה T one או T two שנמדדו ושרטטו אותם. שרטטו ערכים אלו אל מול ריכוז ה-Lathan ביחידות של millimolar והתאימו את הגרף לקו ישר. השיפוע של הקו המותאם הוא פעילות ההרפיה, R one או R two עבור T one ו-T two בהתאמה.

כאן אנו רואים את התרשים הכללי למתילציה וטיהור. תרשים זה מתאר את הפרוצדורה הכללית למתילציה ואת הסיבות לבחירה במסלולי טיהור שונים. כאן אנו רואים גרף מייצג של דעיכת לומניסנציה, שבו הלוגריתם הטבעי של הדעיכה מופלט מול הזמן; שיפועי הקווים שנוצרו מעקומות דומות עבור תמיסות מים ודאוטריום אוקסיד משמשים יחד עם משוואה אחת כדי לקבוע את מספר הקואורדינציה של מים בקומפלקסים המכילים אופיום.

ניתן לראות כאן דוגמה מייצגת של מדידות ליוויטי (livity), כאשר השיפוע של הקו המותאם מייצג את ה-T one livity של הדגימה. בנוסף למספר הקואורדינציה של המים ולאפיון הליוויטי המתוארים בפרוטוקול, חשוב לאפיין גם את המוצרים הסופיים באמצעות טכניקות כימיות סטנדרטיות. ניתן לקבוע את זהות התרכובת באמצעות ספקטרומטריית מסות; כאן מוצגים ספקטראלי מסות מייצגים המראים את דפוסי האיזוטופים האבחנתיים עבור קומפלקסים המכילים גדולניום ואופיום.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ספקטרוסקופיית endr, HPLC ואנליזה אלמנטרית כדי לאפיין יותר את התסמיכים שהתקבלו. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להחזיק בהבנה טובה של האופן שבו מסנתזים, מטהרים ומאפיינים תסמיכים המכילים לנתנידים, אשר ניתן להשתמש בהם לסימון של מקרו-מולקולות ביולוגיות.