Bromodeoxyuridine (BrdU) תיוג ומיון לאחר פלואורסצנטי תא פעיל עבור זיהוי, תרבות עצמאית של פחמן אורגני מומסים משפיל Bacterioplankton

מיקרובים מתווכים את הפירוק של מגוון רחב של סובסטרטים של פחמן אורגני מומס או תרכובות DOC, כגון בסביבות מימיות. כדי להבין באופן מלא את תפקידם של המיקרובים בטרנספורמציה של DOC, נדרש זיהוי סימולטני של הטקסונומיה והתפקוד שלהם. סרטון זה מדגים פרוצדורה לזיהוי טקסונומי של חיידקים חופשיים או פלנקטון חיידקי המבצעים טרנספורמציה של מאגרים ספציפיים של DOC בסביבות מימיות.

דגימות מים שנאספו מסביבת בדיקה מעובדות ומודגראות עם תרכובת רצויה ועם ברומו-דאוקסי-ורידין, BRDU, הנשלב לתוך DNA שסונתז לאחרונה ותאים הגדלים באופן פעיל. לאחר מכן, פלנקטון חיידקי המסומן ב-BRDU מסומן עם נוגדנים נגד BRDU המצומדים ל-ZI. פלנקטון חיידקי עם רמות גבוהות של סימון BRDU מבודל באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה.

לאחר מכן מחלצים DNA מהתאים הממוינים ומבצעים זיהוי טקסונומי בהתבסס על תוצאות של ניתוח גן ה-16 s ribosomal RNA באמצעות PCR. שלום, שמי סטיבן רובינס מהמעבדה של ד"ר צ'ן מאו במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת קנט סטייט. היום אני ולו נראה לכם שיטה שאינה תלויה בתרבית לזיהוי פלנקטון חיידקי המפרק DOC בסביבות מימיות.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תוספי חומרי הזנה ולאחריהם ניתוח של DNA של קהילה חיידקית, הוא שהיא ממקדת את הניתוח בחיידקים בעלי פעילות גבוהה ומסירה תאים רדומים או בעלי קצב צמיחה איטי. אנו מראים כאן את זיהוי הפלנקטון החיידקי המשתמש בתרכובת DOC ספציפית אחת. עם זאת, ניתן להחיל שיטה זו גם כדי לחקור פלנקטון חיידקי המשתמש בתרכובת DOC בודדת אחרת או בקבוצה של DLCs, כגון הפרשות אצות.

אם כן, נדגום מספר דגימות מים ונתחיל. לפני ביצוע בדיקה של דגימות מים לאיתור פלנקטון חיידקי המפרק DOC, יש לעבד את דגימות המים באופן מתאים. הדגימות המוצגות כאן נאספו מחופי ג'ורג'יה, כדי להסיר חלקיקים גדולים ו-ER VREs מדגימת המים.

השתמשו במשאבה פריסטלטית כדי להעביר מים מהבליל לאיסוף ליחידת סינון בעלת מסנן עם גודל נקבים של 1 מיקרומטר. לאחר מכן, העבירו מנות של 36 מיליליטר מהתסנן לשלוש פרועות פוליפרופילן סטריליות בנפח של 50 מיליליטר. כל אחת מהן צריכה להכיל ארבעה מיליליטר של תמיסת 10% Paraformaldehyde שהוכנה זה עתה. דגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי לשמר את התאים לאחר הדגירה.

שפכו את המים אל מגדל הסינון של יחידת סינון בוואקום מזכוכית בעלת מסנני ממברנה לבנים עם גודל נקבים של 0.22 µm והפעילו ואקום כדי לשאוב את התמיסה דרך המסנן. שטפו את המסנן על ידי העברת 10 mL של PBS דרך מסנן הוואקום. סמנו את המסננים כביקורות שליליות ואחסנו אותם בטמפרטורה של 20- °C.

כדי להקים מערכת אקולוגית ניסיונית או מיקרוקוסמוס, התחילו במילוי של שישה בקבוקורי זכוכית של አንድ ליטר שנשטפו מראש ב-800 milliliters של דגימת המים שעברה סינון מוקדם. הוסיפו BRDU לכל מיקרוקוסמוס עד לריכוז סופי של 10 micromolar. סובבו את הבקבוקר במהירות ביד כדי לערבב.

כל דגימה תיבדק בשלוש חזרות. לכן, לשלוש מהמיקרוקוזמים, הוסף את תרכוב ה-DOC המודלי. כאן, reine מתווסף למיקרוקוזמים בריכוז סופי של 100 nanomolar.

לאחר מכן, הוסיפו PBS סטרילי לשלושת המיקרוקוסמוס האחרים. אלה ישמשו כביקרות ללא DOC. הניחו את כל המיקרוקוסמוסים באינקובטור עם ניעור ב-100 RPM, בחושך ובטמפרטורת הסביבה (in situ), שהיא 25 °C. דגמיות יילקחו בנקודות זמן של 0, 8, 16 ו-24 שעות.

אספו 36 מיליליטר מכל מיקרוקוסמוס אל תוך מבחנה פוליפרופילן סטרילית בנפח 50 מיליליטר המכילה ארבעה מיליליטר של 10% paraform aldehyde טרי; הדגירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי לקבע את התאים. לאחר מכן, סננו את התאים המשומרים דרך מסנני ממברנה לבנים בעלי גודל נקבים של 0.22 מיקרומטר. העבירו 10 מיליליטר של PBS דרך מסנן הוואקום כדי לשטוף את שאריות ה-PFA.

עברו מיד לגילוי אימונו-היסטוכימי (INS situ immuno detection) או שמרו את המסננים בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס לצורך בדיקת שילוב BRDU בתוך פלנקטון חיידקי. התחילו בחימום מסנני הדגימות בטמפרטורת החדר כדי לפגוע בדופן התא החיידקי. הניחו את המסנן על יחידת סינון, ולאחר מכן טפטפו באמצעות פיפטה 1 mL של תמיסת ליזוזים על המסנן כך שתכסה את התאים, והדגרירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר הדגירה, יש להפעיל ואקום כדי להסיר את התמיסה. ברגע שהתמיסה עוברת דרך המסנן, יש לשטוף את התאים על ידי הוספה של 10 milliliters של PBS והפעלת ואקום. לאחר מכן, כדי להחליש עוד יותר את דופן התא, יש להוסיף למסנן מיליליטר אחד של תמיסת proteinase K באופן שיכסה את התאים.

הדגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו ב-PBS כדי להפיק שכבות בודדות של DNA. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת exonuclease כדי לכסות את התאים על המסנן.

דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את המסנן על ידי העברת 10 milliliters של PBS דרך מסנן הוואקום. לאחר מכן, גזרו את שולי המסנן כדי להסיר את החלק שאינו מכיל תאים.

לאחר מכן, על משטח יבש שנוקה באלכוהול, השתמשו בלהב סטרילי כדי לחתוך את המסנן לשמונה חלקים שווים בגודלם. נדרשים שמונה תאי דגירה עם אטום מסגרת עבור כל דגימה; הניחו שמינית מהמסנן בתוך תא דגירה עם אטום מסגרת מורכב, כאשר צד הדגימה פונה כלפי מעלה. לאחר הרכבת התאים, השתמשו בערכה לזיהוי שגשוג תאים של Roche Intu cell proliferation kit כדי לזהות תאים המסומנים ב-A-B-R-D-U in situ.

עם סיום הפרוצדורות הקבועות, הוצא את חלק המסנן מתא הדגירה והנח אותו על משטח סטרילי. בעזרת להב סטרילי, חתוך את חלק המסנן לחתיכות קטנות. העבר את חתיכות המסנן לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה בנפח שני מיליליטר המכילה 1 mL PBS, סגור את השפופרת היטב ואטום אותה עם פראפילם. לאחר מכן, דגור את השפופרת במדגירה נערת בטמפרטורה של 37 °C ובמהירות של 200 RPM למשך 10 דקות.

לאחר הדגירה, הדק את השפופרת וערבב אותה במערבל (vortex) במהירות מרבית. במשך חמש דקות, העבר בעזרת פפטור את הנוזל העליון (SUP natant) לשפופרת פוליפרופילן סטרילית בנפח 15 מיליליטר. לאחר מכן, השהה מחדש את המסנן ב-PBS וחזור על שלבי הערבוב והדגירה פעמיים נוספות, ובכל פעם הוסף את הנוזל העליון לאותה שפופרת של 15 מיליליטר עבור כל דגימה.

שמור את התאים לאחר השיתוף (resuspension) בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. יש לנתח את הדגימה באמצעות fax תוך יומיים. לבסוף, בצע מיון תאים כדי להשיג את האוכלוסייה עם רמה גבוהה של שילוב BRDU.

כאן נעשה שימוש בציטומטר זרימה מסוג BD FACS Aria ובתוכנה התואמת לו. לאחר מיון התאים, ניתן לבחון את האוכלוסייה המועשרת ב-BRDU כדי לקבוע את זהותה הטקסונומית. כדי להגביר את הגנים של 16S ribosomal RNA של החיידקים הממוינים באמצעות PCR, העבירו את התאים הממוינים באמצעות פיפט למסנן ממברנת פוליקרבונט לבנה בעלת נקביות של 0.22 µm והפעילו את משאבת הוואקום; בעזרת להב סטרילי, גזרו את השוליים נטולי התאים של המסנן.

חלקו את המסנן לארבעה חלקים שווים עבור כל תנאי, והניחו חלק מסנן אחד בכל אחת משלוש מבחנות תגובת PCR, כאשר התאים פונים כלפי פנים המבחנה. הוסיפו 45 µL של מים בדרגת PCR. המתינו עד שחלק המסנן ישקע לחלוטין במים.

בשלב הבא, הוסיפו שני כדורי PCR מסוג Roche illustra pure T ready to go וערבבו קצרה במכשיר וורטקס כדי לסייע בהמסה של הכדורים. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים מכל אחד מהפריימרים של הגן 16 s ribosomal RNA, קדימה ואחורה.

הוסף מיקרוליטר אחד של BSA כדי לסייע בספיחת מעכבי הגברה, או מיקרוליטר אחד של מים. בצע הגברת PCR במכשיר תרמו-סייקלר. מומלצת תוכנית touchdown PCR, שבה טמפרטורת ההכשרה יורדת באופן רצופי מ-62 ל-52 מעלות צלזיוס, בהורדה של מעלה אחת בכל מחזור, ולאחריה 15 מחזורים ב-52 מעלות צלזיוס.

אשרו את הגברת ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה על ג'לי Agros בריכוז 1% שנצבעו בברומיד, גזרו את אמפליקוני ה-PCR מהג'ל ונקו אותם באמצעות ערכת KaiGen cayo quick gel extraction. לאחר טיהור ג'ל ה-PCR, איחדו את האמפליקונים של אותו הדגימה. אמפליקוני 16s ribosomal DNA מטוהרים מוכנים כעת למספר ניתוחים מולקולריים.

דגימות נאספו מאתר חופי בגאורגיה ועובדו כדי ללמוד על חיידקים מפרקי Racine, בהתאם לנהלים המתוארים בסרטון זה. Racine הוא תרכוב פוליאמורי שניתן למצוא באופן נרחב בסביבות ימיות. הוא יכול לשמש כמקור להזנה ואנרגיה עבור חיידקים ימיים, כפי שמוצג כאן.

ניתוח נתונים של הדגימות גילה כי לאחר דגירה של 24 שעות, התפתחה במיקרוקוסמוסים המתוקנים ב-Racine קבוצת חיידקים בעלת עוצמת פלואורסצנציית FXI גבוהה יותר, אשר הייתה קשורה באופן חיובי להיקף השילוב של BRDU. תאים אלו הוגדרו כתאים בעלי שילוב BRDU גבוה או HI, והיה צפוי כי הם יכילו בעיקר חיידקים המפרקים Racine. לא נמצאו תאי hi.

תאים נמצאו בביקורת ללא תוספת, אשר הכילה תאים בלבד עם רמות נמוכות יותר של שילוב BRDU שכונו תאי lii; היה זה צפוי להכיל בעיקר פלנקטון חיידקי שלא היה מסוגל להשתמש בתוספת. תאי Racine HI שהתווספו מוינו לשפופרות נפרדות ואז נאספו על מסנני ממברנה. אמפליקונים חלקיים של הגן של rRNA ריבוסומלי 16 התקבלו לאחר PCR של המסנן ואושרו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.

לאחר סינון המיון, ניתן לבצע הגברה באמצעות PCR של גנים תפקודיים כדי לבחון את השונות התפקודית בין התאים הממוינים. הראינו לכם כיצד להפריד פיזית ולזהות תאי חיידקים תפקודיים בסביבה מימית באמצעות גישה המשלבת מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) והטמעה של BrDU. זכרו, BrDU הוא חומר מסוכן, ויש ללבוש תמיד חלוק מעבדה וכפפות בעת ביצוע הליך זה.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.