מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לאפיין את הסביבה המכנית המקומית של פרנכימה של הריאה בקנה מידה מרחבי הרלוונטי לתאים השוכנים בה, וזאת באמצעות מדידה ישירה של התכונות האלסטיות המקומיות של רקמת ריאה רעננה באמצעות מיקרו-החדרה (micro indentation) במיקרוסקופיה של כוח אטומי (atomic force microscopy). מטרה זו מושגת על ידי חיתוך של רקמת ריאה של עכבר המנופחת באגר עם תער או להב סקלפל, כדי להכין רצועות של פרנכימה של הריאה באורך וברוחב של חמישה על חמישה מילימטרים, ובבעו 400 micrometers. לאחר מכן, רצועות רקמת ריאה שאינן מקובעות ושאינן חדירות עוברות לצביעה אימונוהיסטוכימית, המזהה אזורי עניין עבור מיקרו-החדרה ב-AFM.

לאחר מכן, מבוצעת מיקרו-החדרה (micro indentation) בשיטת FM על רצועות רקמה ב-PBS בטמפרטורת החדר. תוצאות אלו מתקבלות במטרה למדוד באופן ישיר את התכונות האלסטיות המקומיות של רקמת ריאה טרייה. הן מראות הבדלים בולטים בטווח ובפיזור של קשיחות הרקמה בפארנכימה של ריאות תקינות ופיברוטיות, וכן וריאציות מרחביות גדולות בקשיחות, במיוחד בתוך דגימת הריאה הפיברוטית.

על בסיס מפות קשיחות שהופקו מעקומי העתקה כפויה שהתקבלו באמצעות מיקרו-ההטבעה של FM. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני מדדים קיימים, כגון מתיחה של רצועות רקמה, הוא שהיא מציעה רזולוציה מרחבית חסרת תקדים המספקת נקודת מבט ייחודית על שונות בקנה מידה מיקרוסקופי בקשיחות הרקמה. מדד זה יכול לסייע במתן מענה לשאלות מפתח, כגון כיצד הקשיחות משתנה מרחבית בתוך הרקמה, ומהם ההיקף והקנה המידה המרחבי של שינויי הקשיחות במחלה.

תהליכים הגורמים לעיצוב מחדש של רקמה. כדי להכין רצועות של רקמת ריאה, התחילו בייצוב מבנה הריאה לצורך חיתוך על ידי ניפוח ריאות עכבר מבודדות. הניפו תוך כדי הזרקה תוך-קשקתית (intratracheally) עם 50 milliliters per kilogram ממשקל הגוף של aros בריכוז 2% עם נקודת ג'ל נמוכה שהוכנה ב-PBS; קשרו את הקשקשת וקררו את הריאות המנופחות באמבט PBS בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius למשך 60 דקות. ה-aros יהפוך לג'ל ויתקשה בחללי האוויר כדי לייצב בעדינות את מבנה הריאה. במהלך פרק זמן זה, בעזרת תער או סקלפל, חתכו את רקמת ריאת העכבר המיוצבת ב-aros לרצועות באורך וברוחב של כחמישה על חמישה millimeters, ובעובי של 400 micrometers.

לאחר מכן, שטפו את הרצועות ב-PBS בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות כדי להסיר שאריות aros ולשלול דרכי נשימה וכלי דם גדולים. גזרו רצועות מאזורים סוב-פלאורליים המרוחקים מהסממולי של קשרי הנשימה הראשיים; אם ברצונכם לצלם דרכי נשימה או כלי דם גדולים, גזרו רצועות מרקמת ריאה קרובה יותר לסממולי של קשרי הנשימה הראשיים כדי לבודד אזורים של עניין עבור FM micro indentation. הדמיאו את הרקמה באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה או ביצועי צביעה אימונוהיסטוכימית והדמיאו באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

אנא עיינו בחלק הכתוב של פרוטוקול זה כדי להכיר את ההליך. מיד לפני אפיון FM, הצמידו את רצועות הרקמה לכיסויות זכוכית (cover slips) של 15 מילימטר מצופות poly L lysine, על ידי הרמת הכיסוי מתחת לרקמה הצפה, תוך הבטחה שרצועת הרקמה נפרסת באופן אחיד על פני הכיסוי. במידת הצורך, הניחו את הרצועה בין שתי כיסויות זכוכית, כאשר השנייה נקייה ולא מצופה, והפעילו לחץ קל כדי לסייע להצמדת הרקמה לכיסוי המצופה ב-poly L lysine.

יש לכייל את מערכת ה-A FM לפי הוראות היצרן מיד לפני כל סבב של ניסויי מיקרו-השחקה (micro indentation). לשם כך, קבע שני פרמטרים קריטיים: את קבוע הקפיץ של הקנטילבר (cantilever spring constant) באמצעות שיטת התנודות התרמיות באוויר, ואת רגישות סטיית הקנטילבר (cantilever deflection sensitivity), המהווה פרמטר המשמש להמרה של אות הפלט מהפוטודיודה למרחק הסטייה בפועל של הקנטילבר.

יש לכייל את רגישות ההסטה על ידי השגת עקומה סטנדרטית של דחיסה כפויה (forced displacement curve) ב-PBS על גבי תגית זכוכית נקייה. לאחר מכן, חשב את השיפוע של עקומת הדחיסה הכפויה במדידת עקומת הדחיסה הכפויה. קצה ה-AFM נמתח לעבר פני הדגימה ונסוג מהם במיקום בודד, כאשר הסטת הקניטלב (cantilever) $\Delta D$ מנוטרת כפונקציה של תזוזת הקצה $\Delta Z$. מומלץ להשתמש בקניטלב משולש מסיליקון ניטריד עם קצה כדורי של סיליקט בורון בקוטר $5\ \mu\text{m}$ באמצעות גששי FM בעלי קבוע קפיץ של $0.06\ \text{N/m}$.

אפיינו באופן מכני חומרים רכים עם מודול גזירה הנע בין 100 ל-50,000 pascals. נגבו את המשטח התחתון של כיסוי הדגימה (cover slip) בעזרת נייר סופג, ולאחר מכן הצמידו אותו לשקף זכוכית סטנדרטי באמצעות גריס ואקום. הניחו את שקף הזכוכית על במה של AFM וכסו את הדגימה ב-500 microliters של PBS בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, מקם ראש סריקה של A FM מעל הדגימה. כוונן את שולחן הדגימות של המיקרוסקופ כדי להגדיר את המיקרוסקופ לצפייה דרך העדשות, במטרה למקם את קצה ה-A FM במרכז שדה הראייה. הזז את שולחן דגימות ה-A FM כדי לבחור אזור עניין ברקמה.

לאחר מכן, עברו לצפייה באמצעות מצלמת CCD כדי להקליט תמונת ניגודיות פאזה (phase contrast) ו/או תמונות פלואורסצנציה של הרקמה לפי הצורך. הזיזו את קצה ה-AFM לאטה כלפי מטה עד להגעה למגע מדויק עם הדגימה. אפיון באמצעות מיקרו-הזהרה (micro indentation) של דגימות רכות ב-AFM דורש עומקי הזהרה קטנים כדי למנוע מאמצים מקומיים גדולים, אשר מבטלים את מודל הרץ המשמש לחישוב המודול האלסטי; כדי למנוע מאמצים גדולים, בצעו את ההזהרה במצב טריגר (trigger mode) על ידי הגדרת סטייה מקסימלית של הקנטילבר ל-500 nanometers.

מגבלת סטייה זו תגביל את כוח ההחדרה המקסימלי לפחות מ-30 nano newtons. יש לבחור מהירות חדירה איטית מספיק כדי לבחון תכונות אלסטיות ולא תכונות ויסקו-אלסטיות של הדגימה הרכה. עבור רקמת ריאה, בחר טווח מהירויות של 2 עד 20 micrometers per second עבור מדידה בודדת מאזור עניין.

העבירו את גשושית ה-AFM למיקום הרלוונטי ובצעו דחיסה בודדת כדי לאסוף עקומת כוח-העתקה סטנדרטית. הגשושית תנוע רק בציר Z. עבור מיפוי אוטומטי של אזור עניין, עברו למצב מפת כוחות (force map), ובחרו את גודל הסריקה ואת נקודות הדגימה בתוך האזור שנבחר.

קצה ה-AFM סורק את פני הדגימה בין תנועות הדחיסה ואוסף עקומות דחיקה-כוח בודדות בכל נקודה בתוך רשת דגימה מוגדרת. מצאנו כי מעשי הוא להשתמש ברשת דגימה של 16 על 16 כדי למפות שטח של 80 µm על 80 µm במהירות דחיסה של 20 µm לשנייה, פעולה שניתן להשלים בכ-10 דקות. כדי לחשב את מודול יאנג, התאימו את עקומת הדחיקה-כוח למודל דחיסה כדורי של הרץ באמצעות התאמת עקומות לא-לינארית בשיטת ריבועים פחותים כפי שמוצג כאן, כאשר F equals K sub C times delta D הוא הכוח להטיית הקנטילבר.

K sub C הוא קבוע הקפיץ של הקניטלבר. R הוא רדיוס קצה הכדור, delta השווה ל-delta Z פחות delta D היא העומק של ההחדרה, ו-new הוא יחס פואסון של הדגימות, השווה ל-0.4 עבור רקמת ריאה. כדי להעריך את איכות ההתאמה, חשב את ערך ה-SSR, או את סכום הריבועים של ההפרש בין הנתונים לערכי ההתאמה במהלך התאמת העקומה הבלתי-ליניארית.

יש להסיר מדידות שאינן אמינות או שאינן ניתנות לפירוש על ידי השמטת נתונים מעקומות שגויות עם ערכי SSR גבוהים. במידת הצורך, המיר את המודול האלסטי או את E למודול הגזירה G, באמצעות הקשר E שווה לפעמיים סכום של 1 פלוס ν כפול G. כדי להציג תבניות מרחביות של קשיות שנאספו במצב מפת כוח (force map mode), שרטט את נתוני המודול ומפות קווי גובה, למשל, ברשת של 16 על 16 המכסה שטח של 80 µm על 80 µm.

כדי לעבד כמות גדולה של נתוני עקומות כוח, ניתן לכתוב אלגוריתם מותאם אישית להתאמה אוטומטית של עקומות כוח-העתקה, לחילוץ מודולים או לשרטוט מפות קונטור או גרף ELA. באמצעות אותם הליכים ופרמטרים שתוארו לעיל, דמות זו מראה כי הרקמה נחתכה ונצבעה כראוי. המבנה המזערי של פרנכימת הריאה נשמר היטב, כפי שנצפה בצביעה אימונופלורסצנטית לרכיב ממבנה הבסיס, laminin, ללא קיבוע או חדירה (permeation).

לוחות אלו מראים צביעה אימונופלואורסצנטית לקולגן, אחת בריאות טריות שאינן מקובעות שנלקחו מעכברים שטופלו קודם לכן ב-PBS או טופלו ב-bleomycin כדי להשראת פיברוזיס. מוצגים כאן גרפים של דחיפה-כוח שהתקבלו באמצעות מיקרו-אינדנטציה ב-AFM תחת הפעלת אותו כוח. ראש ה-AFM יוצר שקיעה גדולה באזור רך, מה שמוביל לעקומת דחיפה-כוח שטוחה יחסית המוצגת בכחול, לעומת שקיעה קטנה ועקומת דחיפה-כוח תלולה עבור אזור קשיח יותר המוצגת באדום.

כדי להשיג עקומות כוח נקיות לאחר כל חדירה, יש לסגת את קצה ה-A FM לחלוטין מפני פני הדגם ולוודא שאין מגע לפני החדירה הבאה. מצב זה, שבו אין מגע, תואם לאזור השטוח של העקומה, שבו קצה הפרובה נע ללא סטייה של הקניבאל. איור זה מציג עקומה שגויה טיפוסית ללא אזור שטוח, דבר המתרחש כאשר הקצה אינו נסוג לחלוטין מפני פני הדגם, למשל כאשר דגם רך נדבק לקצה, מה שהופך את קביעת נקודת המגע לבלתי אפשרית אם הקצה לכוד לחלוטין בתוך הדגם הרך.

העקומה עשויה להיראות כך ללא סטייה ברורה, אלא עם רעש קטן. איור זה מציג קשיחות. נתונים שהופקו מעקומות הסטה כפויה והוצגו מרחבית כמפות קשיחות המכונות השתעם של ELAs, שבהן הצבע משתנה בהתאם לקשיחות; השתעמי ה-ELAs מדגימים הבדלים בולטים בטווח ובפיזור של קשיחות הרקמה בפרנכימה של ריאות נורמליות ופיברוטיות, וכן שינויים מרחביים משמעותיים בקשיחות, במיוחד בדגימה של הריאה הפיברוטית.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לאפיין את הסביבה המכנית המקומית של פרנכימה של הריאה, באמצעות מדידה ישירה של התכונות האלסטיות המקומיות של רקמת ריאה טרייה בעזרת מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM).