Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo

אחד האתגרים בלימוד התפתחות במדעי המוח הוא לכידה של מורפולוגיות דנדריטיות ואקסונליות ברמת התא הבודד in vivo. במערכת הריח, נוירונים תחושתיים ריחוניים שולחים את האקסונים שלהם מהאפיתליום הריחוני באף אל הפקעת הריח במוח. ככל שמספר רב של נוירונים תחושתיים ריחוניים מקרינים לעבר הפקעת הריח, הם מתאגדים לאגודות.

דבר זה מקשה על חקר מסלוליהם של אקסונים בודדים והמורפולוגיה של קצותיהם. פיתחנו שיטה להדמיה של נוירונים תחושתיים ריחניים בודדים in vivo באמצעות הזרקה מיקרוסקופית של מבנה GFP הנשאי לנטי-וירוס.

טרנסדוקציה מוצלחת באמצעות לנטי-וירוס מאירה את כל אורכו של אקסון התחושה הריחית, כולל הענפיים הטרמינליים. בנוסף להדמיה של נוירונים תחושתיים ריחתיים בודדים, שיטה זו מאפשרת לנו למניפולציה של ביטוי גנים של גן ספציפי שמעניין אותנו כדי לחקור את תפקודו בהקשר של in vivo. הליך לנטי-וירוס זה מדורג כרמת בטיחות ביולוגית 2 ויש לבצעו במנדף זרימה למינרית.

כדי לשמור על סביבה סטרילית, יש לרסס בתוך המנדף את כל הפריטים המוחדרים אליו ב-70% ethanol; הכין וחמם מראש מקבץ מים בטמפרטורה של 37 מעלות למשך 20 דקות לפחות לפני ההזרקה. אטום שקית אחסון מפלסטיק ממולאת למחצה במים והנח אותה על אינקובטור בעל בלוק חימום ריק.

דבר זה יאפשר לעכברים להתאושש לאחר ההזרקה. מלאו מכל לפסולת ביו-סיכונית ב-10% bleach כדי לחטא את כל החומרים שנחשפו לנגיף. כחלק מהליך זה, הכינו צלחת פתוחה קטנה עם 70% ethanol וצלחת שנייה עם מים מזוקקים סטריליים.

במבתר זרימה למינרית, נשתמש במזרק Hamilton בנפח של 5 µL עם מחט בכיול 33 gauge. דגם זה מאפשר לכוונן את התנגדות הבוכנה על ידי סיבוב חוגת מתיחה הממוקמת בחלקו העליון של תא הבוכנה. תכונה זו מספקת שליטה בנפח ההזרקה המיקרוסקופית לצורך עיקור המחט ותא המזרק.

שאבו והחזירו את האתנול מהצלחת מספר פעמים באופן חוזר. שטפו את מחסנית המזרק על ידי שאיבה והזרקה של מים סטריליים מספר פעמים. הניחו את המזרק בבטחה בצד בתוך תא הזרימה הלמינרית.

סדרו מגבונים אלכוהוליים ליד תחנת ההזרקה. הכינו במה להזרקה המספקת משטח מוגבה שיקל על מיקום העכבר. ניתן להשתמש בצלחת תרבית של 10 סנטימטר הפוכה המכוסה במגבוני Kim wipes.

ניתן להרדימ גורי עכבר באמצעות היפותרמיה עד לגיל הגמילה. גזרו אצבע מכפפת גומי והניחו את גור העכבר בתוך קטע האצבע הגזור. לאחר מכן, הניחו על קרח למשך חמש דקות.

הכפפה תמנע כוויות עור שעלולות להתרחש כתוצאה ממגע ישיר עם הקרח. כדי לוודא הרדמה מלאה, נבצע בדיקת קרח על ידי צביטה של האחוריים ושל ארבע רגלי הגור כדי לוודא שהחיה אינה מגיבה. אנו מוכנים כעת להזרקה מיקרוסקופית של lentivirus. נדגים את הפעולה על גור ניונוטלי.

במידה ומשתמשים בעכבר בגיל מבוגר יותר, יש להחליף את המחט בכיסוי (gauge) 33 במחט רחבה יותר על מנת לחדור את פני השרימה. יש לעקר את שטח האף של העכבר על ידי ניגוב עם פד אלכוהול. הוצא את מלאי הלנטי-וירוס מהמקפיא והפשר על קרח.

הפקנו לנטיווירוס במעבדה באופן עצמאי באמצעות שיטות מבוססות. במהלך פיתוח שיטה זו, מצאנו כי נדרש טיר viral minimal של 10⁹ יחידות זיהומיות למיל' כדי להשיג קצב טרנסדוקציה טוב. שאבו 2 µL מתמיסת המאגר של הלנטיווירוס למזרק Hamilton סטרילי.

הניחו את גור העכבר על גבי במת ההזרקה. אחזו בעור בחלק העליון של הראש באזור האוזניים, ומשכו בעדינות לאחור. ציידנו את מבת העבודה (flow hood) שלנו במיקרוסקופ דיסקציה.

על מנת להכווין את ההזרקות המיקרוסקופיות בצורה מדויקת, חפשו את קווי המתאר של הבצולת הריחית על פני השטח הגבי של הגולגולת באזור המוח הקדמי. יעדי ההזרקה המיקרוסקופית שלנו סוגרים מקרוב את הבצולת הריחית, אך אינם כוללים את הבצולת עצמה. אנו מבצעים ארבע הזרקות לאפיתל הריח של כל גור גור.

מיקומים אלו, המיוצגים על ידי נקודות כחולות, דורשים החדרת מחט בזווית המופנית מדיאלית. שתי ההזרקות הנוספות, המיוצגות על ידי נקודות ירוקות, הן מדורגות, במקום מדיאלי ואנטריורי יותר לבצל האפוף (olfactory bulb). ניתן להחדיר הזריקות הללו בזווית תואמת.

ההמלצות על זוויות המחט ניתנו בהתחשב במיקומו הגבאי של אפיתלריון הריח, הממוקם ברובו מתחת לפקעת הריח. לפיכך, גישה ניצבת היא מוגבלת. הכנס את המחט דרך החלק העליון של חלל האף, כ-3 מילימטרים מתחת לפני השטח של העור.

כדי להגיע לאפיתול הריח. יד מיומנת צריכה להרגיש את הירידה בהתנגדות כאשר מגיעים לחלל הלומן של חלל האף. יש להימנע מאזור זה.

בצע הזרקה מיקרוסקופית של 0.5 µL מתמיסת המלאי של הנגיף לכל מיקום. שוב, בבחירת שני אתרים לכל צד, הן בצד שמאל והן בצד ימין, ארבע הזרקות בסך הכל של 0.5 µL. עבור כל עכבר המשמעות היא צורך בשני µL של נגיף לסשן הזרקה בודד.

שוב, יש להיזהר שלא להחדיר לתוך הפקעת הריח (olfactory bulb) שאריות של תמיסת וירוס או דם שעלולים לדלוף מאתר ההזרקה או מפתחי הנחיריים. בעזרת מגבון אתנול, השליכו את המגבונים למכל המכיל תמיסת אקונומיקה מדוללת, והניחו מיד את העכבר המוזרק על אינקובטור מיטה-מים להחלמה. חטאו את המחט והמזרק על ידי חזרה על הליך הסטריליזציה שבוצע במהלך ההכנה. ניתן להחזיר את העכברים המוזרקים לכלובם 30 דקות לאחר ההחלמה באינקובטור מיטה-מים.

ניתן לחזור על כל תהליך המיקרו-הזרקה שוב בעוד ארבע שעות. אם ברצונכם להגדיל את מספר הנוירונים החושיים האולפקטוריים שיוהדפו, ניתן יהיה להדמיות של נוירונים חושיים אולפקטוריים שהודפקו לאורך התא כולו תוך שלושה ימים בלבד. בעלי החיים יוקרבו ויעברו פרפוזיה לצורך תצפית בנקודת הזמן הרצויה.

כדי להדמינ את מסלוליהם של נוירונים חושיים ריחיים בודדים שעברו טרנסדוקציה ואת קצות האקסונים שלהם, נבצע נתיחה וחיתוך של הפלורה האולפקטורית (olfactory bulb) במישור קורונלי בעובי של 60 מיקרון בשיטות סטנדרטיות. החיתוך יכיל כך את כל שכבות התאים של הפלורה האולפקטורית, כולל צרורי אקסונים של נוירונים חושיים ריחיים וטרמינלי אקסונים, היוצרים סינפסות במבני גלומרולריים השוכנים על פני השטח של הפלורה, כהכנה לביצוע אימונוהיסטוכימיה בשיטת ציפה (floating immunohistochemistry). נבצע חיתוכים סדרתיים של הפלורה האולפקטורית ונאסוף אותם יחד לתוך צלחת תרבית של 10 סנטימטר עם 5 מיליליטר של phosphate buffered saline.

העבירו את החתכים הצפים לבקבוק קוני של 50 milliliter. לאחר שהחתכים שקעו לתחתית הבקבוק, שאבו החוצה את ה-phosphate buffered saline. היזהרו לא לשאוב את החתכים.

ממלאים מחדש את המבחנות ב-10 milliliters של בופר טרי כדי לשטוף שאריות של חומר קיבוע או חומר הטמעה. מעבירים מיד באמצעות פיפט את התוך-תליה למבחנה קונוית של 15 milliliters, תוך הקפדה על איסוף כל הפרוסות הצפות, שואבים החוצה את תמיסת השטיפה, ומבצעים פרפורציה לפרוסות באמצעות תמיסה של 0.3%Triton X 100 ב-phosphate buffer saline ומניחים על פלטפורמת נדנדה למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, ניתן להמשיך בפרוטוקול צביעה אימונו-היסטוכימית סטנדרטי באותה המבחנה קונוית, תוך חזרה על שלבי השאיבה והנדנדה לפי הצורך עבור כלי בנפח זה, תוך שמירה על נפח של 10 milliliters לשלבי הצביעה והשטיפה.

להלן רשימה של נוגדנים המשמשים אותנו לצביעה משולבת (cos stain) של נוירונים תחושתיים ריחוניים שעברו טרנסדוקציה חיובית, ושל אוכלוסיית הנוירונים התחושתיים הריחוניים הכללית. כדי להבטיח חדירה מלאה של הנוגדנים לתוך חתכי פקעת הריח בעובי 60 מיקרון, מומלץ לדגרי רפש למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. משך כל שלב של שטיפה לא יעלה על 20 דקות.

פזרו בעדינות כל חיתוך על גבי למסלידה באמצעות מכחול, והצמידו כל סלידה באמצעות Flora Mount G בתוספת תמיסת צביעת כרומטין. השקיעו מאמץ להסיר את כל הבועות מתוך תווך ההצמדה. הצמידו את החיתוכים בשורות כדי לפשט את שלב הסריקה העוקב.

סרקו שכבות אלו בחתכי הנורונים הצבועים בשיטת אימונו-סטינינג (immuno stain) כדי לאתר סיבי אקסונים וסיומים חיוביים ל-GFP. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ניתן לצלם סיומי עצבים שהודבקו באופן חיובי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. מומלץ לכייל את מישור המיקוד באזור העניין באמצעות ערוצי ה-DPI וחלבון הסימון האולפקטורי (olfactory marker protein).

תוצאות אלו מציגות סיב של אקסון של נוירון תחושתי ריחני בודד וטרמינל של אקסון בתוך הגלומרולס, כאשר CO עם חלבון סימון ריחני (olfactory marker protein) מופיע באדום ו-vlu two באפור; ניתן להדמיאן גם את גופי התא של הנוירונים התחושתיים הריחניים המודבקים ואת הבליטות הדנדריטיות שלהם בתוך אפיתל הריח, במידה ורקמה זו נכללה בשלבי הדיסקציה והצביעה האימונוהיסטוכימית. היטל הקונפוקאל מספק לנו מורפולוגיה מפורטת מאוד של נתיב התפשטות אקסונלית ושל עץ הטרמינלים של נוירון תחושתי ריחני בודד. ניתן לראות את כיפוף סיב האקסון חזרה לעבר היעד הגלומרולרי שלו, כמו גם את פרטי תבנית ההסתעפות שלו בתוך הנוירופיל הגלומרולרי.

שיטת המיקרו-הזרקה של לנטי-וירוס מאפשרת ויזואליזציה של אקסון של תא בודד, של מורפולוגיות של נוירונים תחושתיים ריחוניים, ומאפשרת מחקרים המניפולטיביים בביטוי גנים; טרנסדוקציה של לנטי-וירוס מביאה לאינטגרציה גנומית יציבה של קונסטרקטים. לנטי-וירוס אינו מדביק תאים שכנים באופן סינפטי. ניתן להשיג ויזואליזציה תוך שלושה ימים בלבד, ואושר כי היא נמשכת לפחות שלושה חודשים וככל הנראה נשמרת לפרקי זמן ארוכים יותר.

נוירונים תחושתיים של חוש הריח אינם נדבקים בקלות באמצעות עירוי נזאלי של תמיסת לנטי-וירוס. לכן, בפרוצדורה זו נדרשת מיקרו-הזרקה דרך פני השטח. כך נראית פרוצדורת המיקרו-הזרקה של הלנטי-וירוס שלנו.

אני מקווה שמצאתם את כל המידע הזה מועיל להשגת מורפולוגיות של תא בודד משלכם. בהצלחה במחקר.