Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג'ין

נוהל זה בוחן אינטראקציה בין חלבונים in vivo בין שני ווסתי שעתוק של Arabidopsis, namely SEU ו-LUH. באמצעות שימוש במשלים פלואורסצנציה ביו-מולקולרי, SEU מחובר למקטע הקצאי N של חלבון פלואורסצנטי צהוב, או YFP, ו-LUH מחובר למקטע הקצאי C של ה-YFP בבניית שני הפלסמידים. SEU-NYFP ו-LUH-CYFP מוחדרים באמצעות הפגזה לתאי אפידרמיס של בצל כדי לבחון את האינטראקציה ביניהם.

אינטראקציה בין Seuss ל-LUH גורמת לאסוציאציה של מקטעי הקצה הטרמינלי וה-C של YFP בגרעינים, מה שמוביל לפלואורסצנציית YFP בגרעינים. לאחר דגירה של 16 עד 20 שעות בחושך, קליפות האפידרמיס של הבצל נבחנות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי להדמיא את הפלואורסצנציה. שלום, אני קורטני הולאנדר מהמעבדה של ד"ר Zhi Lu במחלקה לביולוגיה של התא וגנטיקה מולקולרית באוניברסיטת מרילנד.

היום נדגים לכם פרוטוקול לבדיקת אינטראקציה בין חלבונים בתאי בצל באמצעות פืน הגנים BioRad Helios. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדה שלנו לבדיקת אינטראקציות בין חלבונים ומיקום חלבונים בתאי צמחים. בואו נתחיל.

כדי להתחיל בהליך זה, הכינו מחסניות עבור רובה הגנים Helios בהתאם לפרוטוקול הווידאו של JoVE מאת Woods ו-Zeto 2008, המדגים בפירוט את הליך הכנת המחסניות עבור כל הכנה של מחסניות. 50 µg של total plasma DNA מעורבבים עם 12.5 mg של חלקיקי זהב ו-0.5 mg/mL של תמיסת PVP עבור BIFC. בשילוב של אותה הכנת מחסנית, שני ה-plasma DNAs של החלבונים בעלי האינטראקציה המשוערת Seuss המחובר לחצי ה-N terminal של YFP, בקיצור seus, NYFP, ו-LU Homolog המחובר לחצי ה-C terminal של YFP, בקיצור L-U-H-C-Y-F-P.

הכמות המשולבת היא 50 micrograms לכל הכנה, מה שמאפשר ייצור של עד 50 מחסניות עם microgram אחד של DNA לכל 0.25 milligrams של זהב למחסנית. כל מחסנית מיועדת לירי אחד. לאחר הכנת המחסניות, יש לבחון אותן כדי לוודא שחלקיקי הזהב נורהים ביעילות.

עטפו פיסה מרובעת של פאראפילם (paraform) סביב צלחת פטרי. לאחר מכן, הגדירו את לחץ ההליום לערך שבין 150 ל-200 PSI והשליכו את המחסניות שהוכנו acabado אל תוך ריבוע הפאראפילם. התבוננו בחלקיקי זהב עמומים על גבי הפאראפילם.

ניתן להדוף כמויות שונות של חלקיקי זהב על גבי ה-parfum בלחצי הליום שונים. עם זאת, אם אין הבדל משמעותי, יש לבחור בלחץ הנמוך יותר עבור ההפצצה. בדיקה זו מעידה גם על השטח המכוסה על ידי כל סבב ירי.

להכנת רקמות הבצל, קלפו את הקליפה החיצונית מבצל צהוב גדול באמצעות להב תער נקי וחד. חתכו שטח מלבני של שני על שמונה סנטימטרים, לעומק של ארבעה עד חמישה שכבות. הוציאו את רקמת הבצל המלבנית והשליכו את שתי השכבות החיצוניות.

חתכו את השכבות הנותרות של הבצל לחתיכות ריבועיות של כ-1.5 סנטימטר. הניחו את חתיכות הבצל בתוך צלחת פטרי המכילה עיגולים של נייר סינון של 3 mm. הרטיבו במים סטריליים וכסו את צלחת הפטרי.

פיסות הבצל מוכנות להפצצה. ראשית, טענו את המטבעים למחזיקי המטבעים העגולים והלבנים; טענו מטבעים המכילים תכני פלסמיד שונים למחזיקי מטבעים שונים. כל מחזיק מטבעים יכול להכיל עד 12 מטבעים עבור 12 יריות.

כאן טוענים שלושה מחזיקים שונים. המחזיק הראשון מכיל מחסניות עם 35 S-G-F-P-A, מקדם חזק וקונסטיטוטי מנגיף הפסיפס של הכרובית. פלסמיד זה משמש כביקורת חיובית.

המעמד השני נטען עם המחסניות הניסיוניות המכילות כמות שווה של S-E-U-N-Y-F-P ו-L-U-H-C-Y-F-P. מעמד המחסניות השלישי נטען עם מחסניות המכילות תערובת מולרית שווה של וקטור ה-puck spine ושל LUH puck spice. זה משמש גם כביקורת שלילית.

הכנס את הסוללה ואת בטנת הקנה החדשה אל תוך ה-Helios gene gun. וודא שלבטנת הקנה ולרובה מחוברים טבעות ה-O-rings המתאימות. לאחר מכן, הכנס מחזיק מחסנית ריק אל תוך ה-gene gun, כאשר סימון המספר 12 על מחזיק המחסנית פונה כלפי מעלה.

הזיזו את מחזיק המחסנית פעם אחת או פעמיים כדי לוודא שהוא מוכנס כראוי. לאחר מכן, חברו את האקדח למיכל ההליום וכווןנו את הלחץ לטווח שבין 150 ל-200 PSI. עליכם להשתמש במגני אוזניים ולהפעיל את האקדח מספר פעמים על ידי לחיצה ממושכת על כפתור הצד תוך כדי לחיצה על ההדק. הפעלת האקדח כאשר מחזיק המחסנית ריק מנקה את תא האקדח ומבטיחה שהלחץ יציב.

לפני ירי ה-DNA, ניתן לירות פיסה של בצל כאן כביקורת שלילית עבור פלואורסצנציית רקע. כדי לירות את חלקיקי הזהב המצופים ב-DNA, הסר את מחזיק המחסניות הריק והכנס את מחזיק המחסניות הטעון הראשון המכיל את הביקורת החיובית. העבר את מחזיק המחסניות כך שהמחסנית המיועדת לירי תמוקם בתחתית מחזיק המחסניות.

כעת הניחו חתיכות בצל במרכזו של Petri dish ריק, כאשר השכבה הפנימית ביותר של הבצל פונה כלפי מעלה. הניחו את מעטפת הקנה של תותח הגנים על ה-Petri dish והפעילו את התותח. התקדמו למחסנית הבאה וירו בחתיכת בצל אחרת.

חזור על שלב זה עד לצילום של ארבעה עד חמישה חלקי בצל. כל חלק בצל מצולם פעם אחת בלבד לאחר הצילום. העבר את חלק הבצל שהופצץ לצלח פטרי המכיל נייר סינון לח בעובי 3 mm כדי לצלם את מחסניות הניסוי.

עברו למחסנית Holden. שנית, זכרו להחליף את ליינר הקנה כדי למנוע זיהום. ירו בארבעה עד חמישה חלקי בצל כפי שהודגם כעת עבור הביקורת החיובית.

לאחר מכן, העבירו למחסנית Holden מספר שלוש, המכילה את ה-DNA של ביקורת השלילה. ושוב, הניחו ארבע עד חמש חתיכות בצל.

החליפו את דיפון התוף כדי למנוע זיהום. לאחר ההפצצה, כסו במכסים את צלוחיות הפטרי המכילות את חתיכות הבצל.

עטפו אותם בפרפורם כדי למנוע התייבשות. דגרו את חלקי הבצל בטמפרטורת החדר בחושך למשך 16 עד 48 שעות. עם סיום ההפגזה, כבו את הגז ושחררו את הלחץ לפני ניתוק תותח הגנים ממכל ההליום, הבריגו החוצה את תבנית הקנה והוציאו את מחזיק המחסניות ואת המחסניות המשומשות.

לבסוף, נקו את מחזיקי המחסניות ואת התשמיות של הגליל על ידי טבילתם בכלי כימי עם מי סבון וביצוע סוניקציה למשך 20 דקות. לאחר מכן, שטפו במים כדי להסיר את כל שאריות הסבון.

השרו ב-70% ethanol למשך שעה ולאחר מכן ייבשו על נייר סופג. המשיכו לתצפית על חתיכות הבצל 16 עד 20 שעות לאחר ההפגזה. לאחר דגירה של חתיכות הבצל המופגזות למשך 16 עד 20 שעות בטמפרטורת החדר, השתמשו בפינצטה עם קצוות שטוחים כדי לקלף לאט שכבת תאים אחת מהאפידרמיס הפנימי של הבצל.

זוהי השכבה הפונה ישירות לעבר התותח במהלך ההפצצה. הנח את השכבה שקולפה על טיפת מים על זכוכית כיסוי של למסחית, עם זכוכית כיסוי. אך היזהר למזער את כמות הבועות.

Beobserve פלואורסצנציית GFP או YFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה, כגון zeiss axio observer, point Z1 המוצג כאן תחת שדה בהיר (bright field) של המיקרוסקופ. ראשית, בדקו את זרימת הציטופלזמה (cytoplasmic streaming) כדי לוודא שהתאים חיים. כדי לעשות זאת.

חשפו את השקופית לאור של השדה המואר (bright field) למשך מספר דקות כדי לחמם את רקמת הבצל, ולאחר מכן חפשו פלסמידים נעים. זרימה ציטופלזמית אינה תמיד קלה לצפייה, לכן אל תתייאשו אם היא אינה נראית בבירור. לזיהוי פלואורסצנציה, השתמשו במסנני עירור וזיהוי מתאימים עבור GFP או YFP. בדקו גם את הביקורות השליליות, שהן חלקי בצל שהוחדרו עם פלסמיד שאינו פלואורסצנטי.

אותות צהובים חלשים עשויים להופיע מתאים פגועים, משארי תאים ומבצלים. כמו כן, יש לבדוק את הביקורות החיוביות: הפלסמיד המכיל רפורטר פלואורסצנטי המבטא באופן קבוע.

פלואורסצנציית GFP נראית בחלק מהתאים אך לא בכולם. בועות אוויר עשויות אף הן להוביל לפלואורסצנציית רקע. אותי GFP גלויים מתאי אפדרמיס של בצל מעידים כי המחסניות, רקמי הבצל והירי מה-gene gun הוכנו ובוצעו כראוי.

כאן מוצגת הפלורסצנציה העזה שנצפתה מהפלסמיד החיובי ל-35 SGFP. הפלורסצנציה העזה נראית בתא כולו, כולל הגרעין והציטופלזמה. תמונת השדה הבהיר (brightfield) מאפשרת לראות את קווי המתאר התואמים של התאים והגרעינים.

לא כל תא עבר טרנספורמציה. אות פלואורסצנציה של YFP מזוהה בגרעין תאי הבצל כאשר השילוב הניסיוני Seuss, NYFP ו-L-U-H-C-Y-F-P מוחדר לתאי בצל באמצעות הפגזה, מה שמעיד על כך ש-Seuss NYFP ו-L-U-H-C-Y-F-P מקימים אינטראקציה in vivo. עם זאת, פלואורסצנציה זו המתווכת על ידי האינטראקציה חלשה משמעותית מהפלואורסצנציה המתווכת על ידי 35 SGFP בביקורת החיובית.

בנוסף, גורמי השאירה SEUS ו-LUH ממוקמים בגרעינים. לפיכך, הפלואורסצנציית YFP נצפית רק בגרעין. יתרה מכך, מספר התאים הפלואורסצנטיים נמוך באופן משמעותי מזה של בקרת החיוביות 35 SGFP.

זאת משום ש-B FFC עובד רק כאשר שני הפלסמידים השותפים מובעים באותם תאי בצל. לא מזוהה אות פלואורסצנטי בבצלים שהופצצו באמצעות מחזיק המגזין מספר שלוש, המכיל תערובת של puck spine, וקטור ו-L-U-H-C-Y-F-P, כפי שצפוי בביקורת השלילית. כעת הדגמנו כיצד להפציץ תאי בצל כדי לבחון אינטראקציות בין חלבונים באמצעות מערכת ה-gene gun מסוג BioRad Helios.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בבקרה חיובית ושלילית מתאימות, ולדעת כי עוצמת הפלואורסצנציה של BIFC עשויה להיות חלשה יותר ומספר התאים הפלואורסצנטיים עשוי להיות נמוך יותר. זהו כל הפרוצדורה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.