האדם Bioengineering רשתות כלי הדם של עכברים Immunodeficient

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור רשת כלי דם אנושית in vivo. דבר זה מושג תחילה על ידי תרבית של תאים יוצרי מושבות אנדותליאליות המופקים מדם אנושי ותאי גזע מזנכימליים המופקים ממחית עצם אנושית. שני סוגי התאים מעורבבים לאחר מכן לתוך ג'ל מבוסס קולגן, המוזרק תת-עורית לעכבר עם מערכת חיסונית לקויה.

שבעה ימים לאחר מכן, השתל מופק ונבדק לצורך הערכת היווצרות של רשת כלי דם אנושית. לבסוף, ניתן לאמת את נוכחותם של מיקרו-כלי דם ספציפיים לאדם בתוך השתלים באמצעות היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה. היתרון המרכזי של טכנולוגיה זו על פני שיטות אחרות, כגון השתלה כירורגית של מבנה, הוא שהיא פשוטה, קלה לביצוע ואינה דורשת ניתוח.

התחילו בהפשרת מבחנה אחת של E CFCs ודללו מיד את התאים בתוך מבחנה קונית של 15 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של DMEM. סובבו את תגלי השהייה של התאים ב-1200 RPM למשך חמש דקות ותלו את משקע התאים ב-10 מיליליטר של מצע EGM two חם. לאחר מכן, העבירו את התאים לצלחת תרבית רקמות של 100 מילימטר מצופה ב-1% gelatin והדגירו את התאים למשך לילה באינקובטור לח.

בבוקר למחרת, שאבו בעדינות את המדיום ואת התאים שאינם קשורים. לאחר מכן, העשילו את התאים הקשורים עם 10 milliliters של מדיום E GM two טרי. המשיכו בתהליך זה בימים הבאים עד להיווצרות שכבה חד-שכבית רצופה (confluent monolayer).

לאחר מכן, שטפו את התאים עם 10 milliliters של PBS. החליפו את ה-PBS בשני milliliters של tripsin EDTA והחזירו את הפיתה למדגרת למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, תחת מיקרוסקופ, הקישו בעדינות על הפיתה ובדקו אם התאים השתחררו.

אם לא, חזור על הדגירות הקצרות עם ניעור עדין. ברגע שהתאים השתחררו לחלוטין, הוסף שמונה מיליליטרים של מצע EGM two לתאים והעבר אותם למבחנה קונית של 15 מיליליטר. ספור את התאים וסבב אותם בצנטריפוגה במהירות 1200 RPM למשך חמש דקות.

כעת זרעו את התאים על פלטות לתרבית רקמה המצופות ב-1% gelatin בצפיפות זריעה של 5, 000 תאים לסנטימטר רבוע. דגרו את התאים במצע EGM two והזינו אותם כל יומיים עד שלושה ימים עם מצע EGM two. חזרו על הליך זה במעברים הבאים בין מעבר ארבעה לשמונה.

ה-E CFCs יהיו מוכנים לשימוש. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה גם להגדלה של MSCs. יש להחליף את מצע E GM two במצע M-S-C-G-M.

השתמשו בצלחת תרבית ללא ציפוי. התחילו בתת-תרבית כאשר ההסנכרון (confluence) מגיע ל-80%, ובצעו תת-תרבית בצפיפות זריעה של 10,000 תאים לסנטימטר רבוע. ניסוי זה דורש 800,000 E CFCs ו-1,200,000 MSCs לכל שתל.

בדרך כלל מכינים חמישה שתלים בו-זמנית. לתחילת התהליך, שאבו את מצע התרבית מתוך צלחות התרבית, ושטפו כל צלחת תאים ב-10 milliliters של PBS. החליפו את ה-PBS בשני milliliters של trypsin EDTA והדגירו את הצלחות תוך כדי נדנוד עדין.

בדקו את התאים תחת מיקרוסקופ בכל שתי עד חמש דקות עד שכל התאים יתנתקו. לאחר מכן, הוסיפו 8 ml של DMEM ואספו את תמיסת התאים. בתוך מבחנה קונית (conical) של 15 ml, ספרו את התאים והעבירו כמות מספיקה של תאים עבור חמישה שתלים למבחנה קונית אחת של 15 ml.

לאחר מכן, סובבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1200 RPM למשך חמש דקות והסירו את העליון. הכינו בזהירות תערובת של fibrinogen ו-collagen fibronectin על קרח. לאחר מכן, השעו בעדינות רבה את משקע התאים בתערובת הקרה שעל הקרח.

העמיסו את תרחיף התאים לתוך מזרק של 1 mL תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר, וחברו מחט עם מכסה בכילוי 26. שמרו על המזרק המלא על קרח עד להזרקת תערובת התאים. הרדימו ארבעה עכברים נשפנייים (nude) אתיימיים בעלי חסר חיסוני בני ששה שבועות באמצעות תא איסופלורן (ISO fluorine).

לאחר שהעכברים הורדמו ואינם מגיבים ללחיצה על בהונות, יש להמשיך בהזרקות עבור כל עכבר. השתמשו במחט gauge 30 כדי להזריק 50 µL של תמיסות thrombin תת-עורין לאזור הגבי העליון. באותו מיקום, ההריקו 200 µL של תערובת התאים.

בעזרת מחט בכילוג 26, המקרו-מולקולות המוזרקות יגבשו ויהוו בליטה קטנה אך ניכרת מתחת לעור. לאחר ההזרקה, הניחו את העכברים על שכבת גזה למען נוחותם וחימום. עקבו אחריהם עד שיהיו מסוגלים להתנייד.

במהלך שלושת הימים הבאים, בצעו תצפית יומית על מצבו הכללי של בעל החיים. שבוע לאחר ההזרקות, בצעו המתת חסד לעכברים באמצעות פחמן דו-חמצני והוציאו את פגינת הג'ל בניתוח. לאחר השליפה, צלמו את פגינות הג'ל לצד סרגל, ולאחר מכן הניחו כל פגינת ג'ל בתוך קסטרה היסטולוגית והטבילו אותן ב-10% neutral buffered formalin למשך לילה בטמפרטורת החדר.

למחרת, שטפו את הפורמלין בריכוז 10% עם מים מזוקקים. אחסנו את הקסטות ב-PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד לביצוע הערכה היסטולוגית. הכינו חתכים בעובי של שבע מיקרון של השתל הטמון בפרפין.

לאחר מכן, כמתו את צפיפות כלי הדם המיקרוסקופיים בחלק המרכזי של השטלים. בעזרת צביעת H and e, ספרו את מספר כלי הדם לריבוע מילימטר כדי להדגים את מקורם האנושי של כלי הדם המיקרווסקולריים. צבעו את החיתוכים באמצעות נוגדן anti-human CD 31 זמין מסחרית בדילול של one to 100.

תמונת ניגודיות פאזה זו מראה את מורפולוגיית ה"cobblestone" האופיינית לתאי אנדותל בשכבה בודדת (monolayer) קונפלואנטית טיפוסית של eCFCs המופקים מדם טבעי של חבל טבילה. תמונה זו מראה את מורפולוגיית צורת הפסולה (spindle shape) הטיפוסית של MSCs המופקים ממח עצם אנושי. לאחר דגירה של שבוע במארח העכבר, השתל המסומן בקו מקווקו צהוב נראה שונה מאוד מרקמות המארח בהגדלה גבוהה יותר.

כלי דם זעירים מרובים נחשפו כאשר מבני הלומן שלהם מכילים תאי דם אדומים, והם מסומנים בחצי חצים צהובים. כאשר הפקקים נבחנו באופן אימונוהיסטוכימי, לומן כלי הדם הזעירים הגיב לנוגדן מונוקלונאלי ל-CD 31 אנושי. גרעיני התאים נצבעו בצביעה נגדית עם המטין.

בשלב של שליטה מלאה, ניתן לבצע טכנולוגיה זו בתוך אונקיה אחת אם היא מבוצעת כראוי.