CD4 + T-לימפוציטים לכידת באמצעות שבב Microfluidic פנויה ל-HIV
1 באוקטובר 2007
שלום, שמי ריצ'רד לין ואני חוקר כאן בקבוצה של פרופסור TI Mercy בחטיבה למדעי הבריאות וטכנולוגיה של הרווארד MIT. הפרויקט שבו אני עובד הוא כימות ולכידה של לימפוציטים T חיוביים ל-CD4 וחיוביים ל-C3. דם של מטופלים ישמש בסביבות עם משאבים מוגבלים.
כאן לפניי ישנו התקן מיקרופלואידי העשוי מ-PDMS, שזהו Polymethylsiloxane. גובה התעלה עצמה הוא 50 micrometers והנפח הכולל בהתקן הוא 10 microliter. זהו התקן מדויק ביותר שבו נשתמש כדי ללכוד לימפוציטים מסוג T helper.
ביסודו של דבר, זהו מדד האבחנה עבור חולי HIV. פני השטח של המכשיר המיקרו-פלואידי כבר הוכשרו עם חלבון, ובמזרק נמצאים נוגדנים חיוביים ל-CD4. כעת יש לנו רק בופר ביולוגי PBS ב-pH של 7.4, ואנו נזרימה אותו לתוך התעלה כדי לשטוף את עודפי הנוגדנים החיוביים ל-CD4.
בשלב זה, אין צורך לשלוט בקצב הזרימה כיוון שאנו רק מנסים לשטוף את השאריות ואין באמת חשיבות לקצב הזרימה שלנו. כאן יהיו הכניסות למכשיר, ואלו יהיו היציאות, משמאלי וממימינכם כאן. כעת אשטוף את תמיסת הנוגדנים העודפת, ואם תבחינו ביציאה, תוכלו לראות את הנוזל שיוצא; מדובר בכמות מזערית מאוד, אך אם תסתכלו מקרוב תוכלו לראות נוזל יוצא מהתעלה דרך הצינורית.
כעת, לאחר ששטפנו את תמיסת הנוגדנים העודפת, אנו יכולים להתכונן להזרקת הדם. לכן, אני אנתק כעת את הצינור מהכניסה. כעת נפתח מזרק חדש עבור הדם, דם אנושי, דם מלא.
מדובר בדגימה מבריאה ולא בדגימה מחולה, דגימה מנבד בריא, בזמן שאנו נערכים להזרקת הדם למכשיר המיקרופלואידי. כעת נחבר את המזרק למשאבת המזרקים. נפעיל את המשאבה, וניתן לראות את קצבי הזרימה של המזרק; קבענו אותם ל-5 µL לדקה.
כעת נכין את עצמנו להזרקה לתוך הדם. נמקם את משאבת המזרקים בצורה אנכית, כיוון שכפי שאנו יודעים, תאי דם שוקעים, ואנו נרצה שהתאים יזרמו אל תוך הערוץ. לכן, עדיף שהתאים ישקעו לתחתית, שנמצאת ממש ליד הפיתול שלנו.
כעת הכל מוכן לפעולה. הנפח של המכשיר שלי הוא 10 µL ל-10 µL. והנפח שאנו רוצים להזרים אל דופן התעלה הוא גם 10 µL.
כך אני יכול לדעת אם זרם מספיק דם רק על ידי התבוננות בצבע של התעלה; אם היא אדומה לגמרי ומלאה, אדע שזרמו 10 µL ואצטרך להפסיק את מעצור המזרק. כעת אלחץ על כפתור ההפעלה וזה יתחיל; לעיתים לוקח זמן עד שהדם נכנס בפועל לתעלה, ודבר זה נובע במידה רבה מהלחץ.
לדוגמה, כאשר אנו מניחים שם את המזרק, לעיתים נשאב או נזריק את הנוזל בהתאם כדי לווסת את הדם בתוך הצינורית. לכן הדבר עשוי להיארך זמן מה, אך ברגע שהשאיבה לתעלה מתחילה, קצב הזרימה נקבע על ly לדקה, כפי שנדרש. לכן עלינו להיות סבלניים ולהמתין; לעיתים יש להמתין כשתי או שלוש דקות לפני שהדם מתחיל לזרום לתעלה.
ניתן לראות כעת שהדם מתחיל לזרום לתוך התעלה. לפיכך ניתן להבחין שהמכשיר כמעט מלא לחלוטין. כעת נחזיר את הצינור ל-PBS כדי לשטוף את הדם שנמצא בתעלה.
וכדי לעשות זאת, נחזור על הפעולות שכבר ביצענו כדי להסיר את הצינוריות. מכיוון שעדיין עלינו לשלוט בקצב זרימת ה-PBS, אנו עדיין זקוקים למשאבת המזרקים. עם זאת, כיוון שאיננו מזרימים יותר דם, אין צורך להשאיר את משאבת המזרקים במצב אנכי, כיוון שאין תאים ב-PBS.
כעת כשהכל מוכן, נשטוף את הדם מהמכשיר, ואלחץ שוב על כפתור ה-sharp ממש כאן. כפי שניתן לראות, המכשיר מתחיל להתנקות. בשוליים עדיין נותר מעט דם, אך הוא נעלם לאט לאט.
ברגע שכל הדם יסולק, נגדיל את הקצב מ-5 µL לדקה ל-20 µL לדקה. הסיבה לשינוי זה היא שבדם קיימים למעשה שני סוגי תאים בעלי אנטיגנים חיוביים ל-C4. אחד מהם הוא התאים שחיפשנו, הלימפוציטים מסוג T helper.
הסוג השני הוא מה שאנו מכנים מונוציטים. אנו רוצים לוודא שהמכשיר שלנו לוכד באופן ספציפי רק את הלימפוציטים מסוג T helper, ולא גם את הלימפוציטים מסוג T helper וגם את המונוציטים. והשיטה שבה אנו עושים זאת היא על ידי הגדלת קצב הזרימה, כיוון שידוע לנו שמונוציטים גדולים יותר בתאיהם מתאי T helper.
לכן, על ידי הגדלת קצבי הזרימה, המונוציטים הגדולים יותר יחוו לחץ רב יותר לעזוב את הפני השטח מאשר תאי T helper חיוביים ל-CD4. כעת זה לוקח בערך 20 דקות. כרגע בידי יש תמיסה.
זהו תמיסות ריסוס (lysing solution). מטרתה במקרה זה היא להמיס תאי דם אדומים. כך, בכל מקום שבו נותרו תאי דם אדומים בתעלה, תמיסה זו תמיס אותם.
זה끔 מהול פי 10 מהתמיסת המקור. כעת נמסיק להפסיק את פעולת משאבת המזרקים, להסיר את הפיתול ולהחליף את התמיסה בזו שבמזרק זה. אני עוצר כעת את המכונה, מסיר את הפיתול, מנתק אותו ומחליף אותו במזרק חדש.
בסדר, עכשיו כשסידרתי את הכל, נחזיר את קצב הזרימה ל-5 µL לדקה. לכן נלחץ על הקצב, נשנה אותו מ-20 ל-5, וכעת נזרים את תמיסת ה-fax license למשך 20 דקות. כעת נלחץ על start.
כעת מופיעה לפנינו תמונה אופטית של המכשיר שצולמה בהגדלה של 10x. ניתן לראות את כל הנקודות הלבנות הללו. כיצד נוכל לוודא שתאים אלו הם אכן התאים שאנו מחפשים?
לפיכך, אנו משתמשים במספר צבעים שונים כדי לוודא; הצבע הראשון שבו אנו משתמשים נקרא DPI, והוא צובע את הגרעין. באופן בסיסי, כל התאים בעלי גרעין, כגון תאי דם לבנים, ייצבעו, בעוד שתאי דם אדומים, שאין להם גרעין, לא ייצבעו, וניתן לראות זאת לכל אורך התמונה. אלו הן כל הנקודות הכחולות הללו, וכל אחת מהן צבועה בכחול.
הוא תא. לכן, השלב הבא הוא לבדוק אם לתאים יש את מה שאנו מכנים אנטיגן C4 חיובי. זה חשוב ביותר מכיוון שהמטרה הכוללת של המכשיר שלנו היא ללכוד תאים עם C4 חיובי.
אם כן, הנוגדן הפלואורסצנטי הבא שבו אנו משתמשים הוא כמובן ספציפי ל-C4. נעבור לשקף הבא. בתמונה זו, התאים נראים עמומים הרבה יותר מכיוון שהנוגדן הפלואורסצנטי שבו השתמשנו הוא בדרך כלל עבור facts.
לכן הדילול גבוה בהרבה. אך אם תסתכלו מקרוב, עדיין ניתן להבחין בנקודות הפזורות בשדה הראייה. הן עמומות למדי.
אך בבחינה מקרוב נוכל לראות שתאים אלו הם CD4 חיוביים, וזה טוב מכיוון שזה בדיוק מה שאנחנו מחפשים. והבדיקה הבאה היא, כפי שהזכרתי קודם, שישנם שני סוגים שונים של תאים CD4 חיוביים. חלקם הם אלו שאנו רוצים, תאי T מסייעים (T helper cells), והשניים הם אלו שאנו מכנים מונוציטים.
לכן אנו זקוקים שוב לנוגדן פלורסצנטי נוסף כדי להבחין בין שני התאים. ידוע כי בלימפוציטים מסוג T helper קיימים עליהם אנטיגנים שאנו מכנים CD3 positive, בעוד שמונוציטים אינם מחזיקים בהם.
כך, הנוגדן הבא שבו נשתמש הוא ספציפי ל-CD3, כפי שניתן לראות בתמונה זו. שוב, ניתן להבחין בנקודות המפוזרות על פני המכשיר; הנקודות נראות גדולות יותר מכיוון שלעיתים תאים מסוימים פשוט זוהרים בעוצמה רבה יותר מאחרים. כלומר, במקרה זה דברים רבים תלויים במקריות, אך ברוב המקרים, נקודות אלו, הנקודות האדומות הבהירות, הן כולן תאים.
לכן, שוב, מה שאנו רוצים הוא, ראשית, לוודא שהתאים שלנו הם CD4 positive ו-CD3 positive. במקרה זה ניתן לראות שרבים מהתאים שלנו הם CD3 positive, וזה טוב. זה מעניק לנו ספציפיות בתהליך הלכידה.
הנקודות הגדולות עלולות להיות פסולת, אך במקרים רבים מה שקורה הוא ש לעיתים תא פשוט צבר יותר CD3, כלומר CD3 על פניו. בתמונה זו, זהו אחד הנתונים שאספנו עבור התקן מיקרו-פלואידי זה, והוא למעשה פרוטוקול ללכידת תאים. בשקופיות הקודמות, כפי שניתן לראות, היו תמונות רבות עם תאים עליהן.
אך למה הם באמת מצטברים? ובכן, הם מצטברים לפרופיל לכידת תאים, שבמקרה זה נוכל להושיג כאשר בציר X נסמן את המרחק מהכניסה ובציר Y נסמן את דיסק לכידת התאים. וניתן לראות שלאורך המכשיר, אתם יודעים, הצפיפות שלכם היא גבוהה ביותר בתחילה ואז פוחתת באיטיות, וזה מה שהיינו מצפים לו מכיוון שאנו לוכדים תאים חיוביים ל-C4 וחיוביים ל-C3 מזרם הדם, ויהיה ריכוז פוחת של תאים אלו בדגימת הדם.
וכך מוצגים בדרך כלל הנתונים שלנו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בכימות ובלכידה של לימפוציטים T חיוביים ל-CD4 וחיוביים ל-C3 מדם של מטופלים באמצעות מכשיר microfill. המכשיר תוכנן לשימוש בסביבות עם משאבים מוגבלים, ומדגים את הדיוק והיעילות שלו בלכידת לימפוציטים T מסייעים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- הנדסה ביו-רפואית
רקע
- לימפוציטים T חיוביים ל-CD4 ממלאים תפקיד מכריע בתגובה החיסונית.
- בסביבות עם משאבים מוגבלים חסר לעיתים קרובות ציוד מתקדם לניתוח תאים.
- התקנים מיקרופלואידיים יכולים לשפר את דיוק לכידת התאים.
- הבנת אוכלוסיות של תאי T חיונית ליישומים רפואיים מגוונים.
מטרת המחקר
- פיתוח התקן מיקרו-מילוי (microfill) ללכידת אוכלוסיות ספציפיות של לימפוציטים T.
- מתן אפשרות לניתוח יעיל של תאי T בסביבות מאתגרות.
- שיפור הנגישות לכלי מחקר אימונולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון וייצור של התקן מיקרופלואידי מבוסס PDMS.
- אפיון של ממדי התעלות ונפח ההתקן.
- יישום של ההתקן ללכידה של לימפוציטים T חיוביים ל-CD4 ו-C3.
- בחינת ביצועי ההתקן בתנאים המדמים מחסור במשאבים.
תוצאות עיקריות
- התקן המיקרו-מיל (microfill) לכד תאי לימפוציטים מסוג T helper בהצלחה.
- מימדי ההתקן עברו אופטימיזציה ללכידה יעילה של תאים.
- הוכשר פוטנציאל לשימוש בסביבות עם משאבים מוגבלים.
- התוצאות מעידות על דיוק גבוה בכימות הלימפוציטים.
מסקנות
- המכשיר המיקרופלואידי שפותח הוא כלי מבטיח למחקר אימונולוגי.
- הוא נותן מענה לצורך בשיטות נגישות לניתוח תאים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב להגדרות קליניות ומחקריות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
גישה מיקרופלואידית זו מאפשרת כימות ולכידה מדויקים של לימפוציטים T מסוג +CD4 מדם מלא, ובכך היא נותנת מענה לצורך קריטי בניטור חיסוני נגיש בסביבות בעלות משאבים מוגבלים. באמצעות שילוב של לכידה באמצעות נוגדנים ספציפיים עם הבחנה מבוססת זרימה בין סוגי תאים, השיטה תומכת בתיקוף מטרות בשלב מוקדם ובהערכת סמנים ביולוגיים במחקר על HIV. פשטות הפלטפורמה והדרישות לנפח דגימה נמוך מגבירות את הפוטנציאל שלה לפריסה בתהליכי עבודה של אבחון מבוזר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של ביטוי משותף של CD4+ ו-CD3+ כדי לתקף את הספציפיות של לימפוציטים מסייעי T בפרופיל חיסוני.
- ערך תפעולי: משתמש בשבב PDMS חד-פעמי עם ממדי תעלות מוגדרים (גובה 50 µm, נפח 10 µL) ללכידה רפרודוקטיבית של תאים ללא זיהום צולב.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מקל על הכנת לימפוציטים שנלכדו לצורך צביעה והדמיה בהמשך, מה שמאפשר קריאות סטנדרטיות של ביטוי סממנים על פני השטח.
- ערך תפעולי: תומך בהחלפת ריאגנטים סדרתית (שטיפת נוגדנים, פרפוזיה של דם מלא, שטיפה ב-PBS, ליזיס של RBC) באמצעות בקרת משאבת מזרקים, מה שמאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה בין מפעילים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר הבחנה בין מונוציטים לתאי T מסייעים (T helper lymphocytes) על בסיס שימור תלוי-גודל תחת זרימה מוגברת (20 µL/min), ובכך משפר את הספציפיות של אוכלוסיות התאים שנלכדו.
- ערך תפעולי: מייצר פרופילי לכידה מרחביים כמותיים (מרחק מהכניסה לעומת צפיפות תאים) המתואמים עם ריכוז התאים בבסיס, ובכך תומך בכיול הבדיקה ובניטור לאורך זמן.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, שבהם פנוטיפ של תאי חיסון מספק מידע על מעורבות המטרה ומנגנון הפעולה, ובמיוחד בתוכניות לפיתוח חיסונים או תרופות אימונומודולטוריות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות בנוגע לתדירויות תתי-אוכלוסיות של CD4+ ומצבים פונקציונליים בדגימות דם ללא צורך בפרקציונציה מורכבת.
- סריקה: מספקת לכידה סטנדרטית ו可שחזרת של לימפוציטים מטרה, התומכת במוכנות של הבדיקה לקמפיינים של סריקת נוגדנים או מולקולות קטנות.
- אנליזה: מספקת נתוני התפלגות מרחבית כמותיים ותיקוף של סמן כפול (CD4+/CD3+) להשוואה בין תנאים או תורמים.
- מחקר תרגומי: תומכת ברציפות מלכידה ex vivo ועד לאפיון פנוטיפי, דבר הרלוונטי לתיקוף ביומרקרים במודלים של מחלות זיהומיות.
- שימוש חוזר ארגוני: תכנון השב disposable והתאימות למשאבת מזריק מאפשרים שימוש חוזר בפלטפורמה במגוון מחקרים עם מינימום תיקוף מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בבידוד תאי חיסון על ידי מתן אפשרות ללכידה ספציפית ואישור פנוטיפי של לימפוציטים מסוג T helper CD4+ .
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות נפחי נוזלים סטנדרטיים, קצבי זרימה מבוקרים (5 µL/min ללכידה, 20 µL/min להדרה של מונוציטים), ושלבי שטיפה/ליזיס מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go בתיקוף מטרות (target validation) על ידי אספקת נתונים כמותיים ואמינים של תאי חיסון מדגימות שעברו עיבוד מינימלי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים לאימונומודולציה בהתבסס על מדדי מעורבות מטרה (target engagement) הדירים בתאי אדם ראשוניים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול במיקרופלואידיקה, צביעה פלורסצנטית ומיקרוסקופיה לצורך זיהוי וכמות תאים מדויקים.
- תלוי בגישה למשאבות מזרקים, צינורות ומיקרוסקופיה פלורסצנטית לצורך ההקמה והקריאה.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ציפוי נוגדנים, חסימה וצביעה בין המשתמשים השונים כדי להבטיח יעילות לכידה עקבית.
- יש להתחשב בשונות של דגימות דם ראשוניות (למשל, hematocrit, ספירת לוקוציטים) בעת פירוש יעילות הלכידה והפרופילים המרחביים.
- מגבלות מעשיות כוללות סיכון לסתימה של המכשיר בעת שימוש בדם מלא ותלות בטכניקה של המפעיל להנחלת זרימה אופטימלית ומניעת בועות.
