Quantitation וניתוח של היווצרות של HO-Endonuclease מגורה טרנסלוקציות כרומוזומלית ידי Strand-סינגל חישול ב Saccharomyces cerevisiae

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את השליטה הגנטית של היווצרות טרנסלוקציה באמצעות kneeling של גדיל יחיד בתאי שמרים דחליליים (budding yeast) דיפלואידיים. הדבר מושג תחילה על ידי חיסון תרביות עם מושבות בודדות בעלות גנוטיפ ספציפי וגידולם למשך לילה. השלב השני של הפרוצדורה הוא השראת היווצרות סימולטנית של שבירה של גדיל כפול על ידי ho endonuclease בשני כרומוזומים, באמצעות הוספת גלקטוז לתרביות.

דילולים נוספים של תרביות אלו נזרעים על מצעים סלקטיביים ולא סלקטיביים. השלב הסופי הוא קביעת תדירות התעתוק על ידי ספירת המושבות שצמחו על המצעים הסלקטיביים והלא סלקטיביים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות בקרה גנטית על היווצרות התעתוק על ידי גדיל בודד, המשתקפת בשינויים בתדירות היווצרות התעתוק המושרה במאבקים בעלי גנוטיפים שונים.

השלכותיה של טכניקה זו חולות על התוצאות של חשיפה לקרינה טיפולית בחולי סרטן, מכיוון ששבירות של גדילי DNA כפולים ויצירת טרנסלוקציות הן התוצאות העיקריות של טיפול זה. כדי להתחיל בהליך לקביעת תדרי טרנסלוקציה מושרית על ידי ho, יש להחדיר מושבות בודדות של הגנוטיפ הרצוי ל-10 עד 20 תרביות נפרדות של 1 ml במצע YPD עם גליצרין ולאקטט; דגרו את התרביות למשך לילה ב-30 °C על רטט. כאשר התרביות הגיעו לצפיפות התאים הרצויה, הוסיפו גלקטוז 20% לתרביות עד לריכוז סופי של 2%. הגלקטוז ישרה את הביטוי של האנדונוקלאז ho, אשר יגרום לשבירות של גדילים כפולים באלל history delta 5' בכרומוזום 3 ובאלל has 3 delta 3' בכרומוזום 15. דגרו למשך ארבע שעות ב-30 °C על רטט.

השלב הבא הוא קריטי להצלחת הפרוצדורה. דילול מדויק ופיזור של התרביות על מצע הם הכרחיים. כדי לקבל תדרי translocation הניתנים לשחזור מספיק כדי לאפשר השוואות מובהקות סטטיסטית בין זנים בעלי גנוטיפים שונים, לאחר ארבע שעות, פזרו דילול מתאים של התרביות על מצע ללא histidine וכן על YPD, כך שיהיו כ-100 עד 200 מושבות לכל צלחת. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עד שלושה ימים.

כאשר מופיעות מושבות, ניתן לקבוע את תדירות התעברות המקום (translocation). יעילות הזריעה לפני ואחרי השראת ביטוי של אנדונוקלאז ho תצביע על כך אם נוכחותו או היעדרו של כל אחד מכרומוזומי התעברות המקום משפיעים על היכולת לשרוד היווצרות של שבירה דו-גדילית (DSB). שבירת עותק אחד הן של כרומוזום 3 והן של כרומוזום 15 תשמש לקביעת יעילויות הזריעה לפני ההשראה.

ראשית, העבירו מנה (aliquot) של תאים מכל תרבית שגדלה למשך לילה וקבעו את מספר התאים על ידי ספירה עם המוציטומטר (hemo cytometer). לאחר מכן, השתמשו בדילול מתאים כדי לזרוע כ-100 עד 200 תאים על מצע YPD והדגירו למשך יומיים עד שלושה בטמפרטורה של 30 °C עד להופעת מושבות. הוסיפו גלקטוז בריכוז 20% לתרביות הנותרות עד לריכוז סופי של 2% והדגירו בטמפרטורה של 30 °C למשך ארבע שעות כדי לקבוע את יעילות הזריעה לאחר ההשראה.

הסיר מנה (aliquot) של תאים מכל תרבית לאחר ארבע שעות של השראה וקבע את מספר התאים באמצעות המוציטומטר (hemocytometer). ספור כ-100 עד 200 תאים באמצעות דילול מתאים על מצע YPD, והדגר למשך יומיים עד שלושה ב-30 °C עד להופעת מושבות. לאחר הופעת המושבות על הצלחות, ניתן לקבוע את יעילות הזריעה. ניתן לבחון שיבוטים (clones) שחשודים כנושאי טרנסלוקציה באמצעות Southern blot.

פרוצדורה זו משתמשת ב-DNA גנומי שהוכן ממושבה רקומביננטית אחת של hiss מכל ניסוי עצמאי. יש לעכל בקירוב 4 µg מכל דגימת DNA באמצעות anzre BAM H1, להפריד את המקטעים שעוברו ב-BAM H1 על גבי ג'ל agarose בריכוז 0.7%, ולאחר מכן להעביר אותם לממברנת ניילון טעונה חיובית שעברה היברידיזציה עם פרובה המסומנת ב-P 32, שהוכנה באמצעות random priming עם clone גנומי של BAM H1 בגודל 1.8 kb המכיל את הגן HIS3. יש להדגים את מקטעי ה-DNA באמצעות auto radiography או phospho imaging. דרך נוספת לבחון שיבוטים שחשודים כנושאי טרנסלוקציה היא באמצעות ניתוח chromosome plot.

ראשית מכינים כרומוסומים מrecombinants נבחרים של hiss בתוך plugs של agarose; מפרידים את הכרומוסומים בג'ל agarose בריכוז 1% באמצעות שדה חשמלי הומוגני clamped homogeneous electric field (CHEF) בטמפרטורה של 14 °C. הפרמטרים הבאים מיושמים: בלוק ראשון 14 °C, זמן החלפה של 72 שניות ו-15 שעות ב-6 V/cm; בלוק שני 14 °C, זמן החלפה של 122 שניות ו-11 שעות ב-6 V/cm. עם סיום האלקטרופורזה, ויזואליזציה של הכרומוסומים תתבצע על ידי צביעת הג'ל ב-EtBr למשך 30 דקות, לאחר מכן הקרנה ב-UV והסרת צבע במים מזוקקים; העברת הכרומוסומים לממברנה טעונה חיובית תבוצע באמצעות פעולת נימיות.

תנאי דנטורציה מיועדים להכלאה (hybridization) עם גשוש (probe) מסומן ב-P 32 שהתקבל באמצעות priming אקראי של קלון גנומי bam H one bam H one באורך 1.8 kilobase המכיל את הגן hiss. Three. יש להמחיש את הכרומוזומים באמצעות רדיוגרפיה עצמית או דימוי פוספורי.

בדוגמה זו, תדירות הרקומינציה המחושבת היא כ-3%. ניתן לבצע את הבדיקה של תדירויות טרנסלוקציה מושראות ב-ho באמצעות זנים בעלי גנוטיפים שונים, כדי להשוות הבדלים ביכולת לתיקון שברים דו-גדיליים באמצעות גדיל יחיד, כפי שמוצג בגרף מייצג זה. תדירויות הטרנסלוקציה שהתקבלו הן באופן סלקטיבי והן באופן לא סלקטיבי עם ההומוזיגוט RAD 51 delta null היו שונות סטטיסטית מאלה שהתקבלו בתנאים תואמים עם זן הפרא, הן לפני והן אחרי פריסה במונחי אינדוקציה.

הנצילות נקבעת על ידי חילוק מספר התאים החיים הכולל המ forming colony במספר הגופים התאיים הכולל בתרבית, כפי שנקבע באמצעות ספירה בהמוציטומטר, כפי שמוצג בטבלה זו לפני ואחרי זריעה להשראה. הנצילויות לא היו שונות באופן מובהק עבור תאי wild type, מה שמעיד על כך שנוכחותם או היעדרם של התעתוקים הכרומוסומליים אינם משפיעים על היכולת לשרוד. היווצרות DSB.

ניתן לבחון שיclones שייתכן ונושאים טרנסלוקציה באמצעות אנליזה של סאות'רן בלוט גנומי. כאן מוצג ייצוג גרפי של כרומוזומים רלוונטיים לפני ואחרי היווצרות הטרנסלוקציה. גדלים של מקטעי רסטריקציה המכילים רצפים רלוונטיים, אשר נוצרו על ידי עיכול BAM H one של DNA גנומי מזנים הורי ורקומביננטיים ונחשפו בבלוטים באמצעות היברידיזציה עם BAM H one בגודל 1.8 kilobase.

שלושת השיבטים הגנומיים של His רשומים בזוגות קילו-בסיסים לצורך אנליזת Southern blot. DNA גנומי מעובד עם האנדונוקלאזה BMH one ועובר היברידיזציה עם פרוב His three של 1.8 קילו-בסיסים המסומן ב-P 32 כדי להדגים מקטעים אבחנתיים אלו.

קטעים של 0.8 kilobase HIS three delta 201.7 kilobase hiss three delta three prime, 4 kilobase T 3 15, 5 kilobase T 15 three ו-8 kilobase hiss three delta five prime. נתיב A הוא הדיפלואיד ההורה. נתיב B הוא רקומביננט של translocation לא-הדדי hiss plus ונתיב C הוא translocation הדדי his plus.

ניתן להשתמש בניתוח BLO כרומוזומלי רקומביננטי גם כדי לבחון שיבוטים הנושאים טרנסלוקציה. כרומוזומים שלמים שהוכנו בתוך פלגי agarose מופרדים באמצעות electrophoresis של שדה פולסים, והג'ל נצבע ב-ethidium bromide ומוצג תחת תאורת UV. הכרומוזומים המופרדים מועברים לאחר מכן לניילון (blotted) ועוברים היברידיזציה עם גשון של 1.8 kilobase המסומן ב-P 32.

מעבדה להדגמה של כרומוזום 1 שלם בגודל 1.1 megabase, כרומוזום T15 תעתוק בגודל 15.8 megabase, כרומוזום T315 תעתוק בגודל 0.6 megabase, וכרומוזום 3 שלם בגודל 0.3 megabase. נתיב A הוא הדיפלואיד ההורה. נתיב B הוא רקומביננט עם translocation לא-הדדית של his+, ונתיב C הוא רקומביננט עם translocation הדדית של his+.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לקבוע את תדירות היווצרות הטרנסלוקציה בעקבות שברים כפולי גדיל שגורו על ידי מספר עותקים של ho.