עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין
18 בנובמבר 2011
הדמיה מיקרוסקופית של תאים אנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מאפשר אפיון של שינויים דינמיים מבנים cytoskeletal. שלא כמו טכניקות להשתמש דגימות קבוע, שיטה זו מספקת הערכה מפורטת של השינויים הזמני cytoskeleton אקטין בתאי אותו לפני, במהלך ואחרי גירויים פיזיים, תרופתי, או דלקתיים שונים.
מטרת פרוצדורה זו היא לצפות בשינויים דינמיים בשלד האקטין של תאי אנדותל חיים. ראשית, בצע טרנספקציה של תאי אנדותל מווריד טביליות אנושי (HUVECs) באמצעות פלסמיד A GFP beta actin, וגודל אותם עד להגעה לקונפלואנציה על לבישי זכוכית (cover slips). לאחר מכן, מקם את לבישי הזכוכית בתא דימוי של תאים חיים עם במה מחוממת והזרמה של תמיסה פיזיולוגית המכילה אלבומין.
השלב הסופי הוא רכישת נתונים של אזור תאים נבחר באמצעות צילום time-lapse לפני ואחרי טיפול בחומר פרמקולוגי. ניתוח גרפי של התנועה באמצעות תוכנת דימוי כגון Image J יכול לספק תובנות לגבי בליטות podia מקומיות, כגון מרחק, זמן ומהירות של הבליטות, וכן תנועת סיבי אקטין לאורך זמן. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימוי אימונופלואורסצנציה, הוא שדימוי תאים חיים מאפשר שילוב של הטבע הדינמי של ה-act ושל שלד התא במחקרים על המנגנונים הקובעים את חדירות האנדותל.
בעוד שתאים צבועים ומקובעים מייצגים תמונות רגעיות בזמן ומספקים מידע מוגבל על הדינמיקה של ה-act ושל השלד התאי לפני ואחרי טיפול במתווך דלקתי, בתוך מabilis בטיחות ביולוגית. עקרו לוחות כיסוי עם 70% ethanol למשך שתי דקות ולאחר מכן ייבשו באוויר. מקמו כל לוח כיסוי בתוך צלחת תרבית של 10 סנטימטר והוסיפו 300 microliters של תמיסת ג'לטין חמה למרכז, ללא מגע עם קצוות לוח הכיסוי. לאחר חמש דקות, שאבו את הנוזל.
כעת קצרו תרבית בצפיפות גבוהה (confluent) של תאי אנדותל מווריד טביליות אנושי, או VE, באמצעות 0.25% tripsin EDTA. ספרו את התאים ורכזו אותם על ידי סבוב במערכת צנטריפוגה. שאבו כמה שיותר מתווך ה-SUP natum לצורך תגובת טרנספקציה עם ערכת ה-VE nuclear effector.
יש להשעות מחדש את משקעי התאים בתוך תמיסת nuclear effector בסיסית ולהוסיף 0.2 עד שני מיקרוגרם של פלסמיד וקטור GFP beta actin. העבר 100 microliters של תרחיף תאים לתוך nuclear effector qve. הקיש מספר פעמים על ה-vete המכוסה כדי לוודא שאין בועות בין תחתית ה-Q vet לבין דגימת הטרנספקציה.
הכנס את ה-Q VET למכשיר ה-nuclear effector two והפעל את תוכנית A 0 3 4. בעזרת פיפטה להעברה מהערכה של ה-nuclear effector, העבר כמות מחוממת של 500 microliters של מצע EGM two MV אל ה-qve. לאחר מכן, העבר את התערובת בחזרה לשפופרת המיקרו-צנטריפוגה והדגר למשך 15 דקות. ערבב בעדינות את תרחיף ה-VE שעבר טרנספקציה פעם אחת, וטפטף 300 microliters מהתרחיף על לבישת זכוכית מצופה ג'לטין ללא מגע בקצוות.
לאחר מכן, דגרו למשך שעה עד ארבע שעות. בדקו את התאים שעברו טרנספקציה כדי לוודא שהם נצמדו לכיסוי הזכוכית (cover slip). לאחר מכן, הוסיפו למנה 10 milliliters של מצע E GM two MV, והמשיכו בדגירה לצורך ביטוי של GFP.
ראשית, יש להוסיף תוצר של תמיסת מלח פיזיולוגית עם אלבומין או PSS למערכת הזרימה בכוח הכבידה ולחברה אותה למחמם השורה. כעת, יש לכוונן את וסת הזרימה כדי להשיג קצב זרימה של כ-40 milliliters per hour. לאחר מכן, יש להפסיק את הזרימה על ידי סגירת הברז באמצעות מקלון צמר.
מרחו גריז ואקום על הקצה החיצוני של הצד התחתון של אמבט היהלום. כעת הוציאו תרבית שעברה טרנספקציה מהאינקובטור. הרימו בעדינות את כיסוי הזכוכית (cover slip) באמצעות פינצטה.
לאחר מכן, בעזרת נייר ניגוב מסוג Kim wipe, ספגו את עודפי מצע ה-EGM two MV מהשקופית התחתונה, כאשר פני התאים פונים כלפי מעלה. הניחו את אמבט היהלום מעל לכיסוי הזכוכית כדי ליצור תא. העבירו במהירות את התא אל מחמם הבמה.
הדקו את התפסנים מעל התא והעבירו בפיפטה כ-1 mL של מצע EGM two MV מהפלטה אל תוך התא. כעת חברו את צינור הוואקום למחזיק שלו בצד שמאל של התא ואת קו ה-A PSS מהמחמם המקוון (inline heater) אל התעלה בצד ימין של התא. לאחר מכן, הפעילו את הוואקום ופתחו את קו ה-A PSS כדי לאפשר פרפוזיה של האמבט מעל התאים שעברו טרנספקציה.
הפעילו גם את המחמם השורה (inline heater) בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, הניחו את חיישן התרמיסטור של הבמה המחוממת לתוך האמבטית בקו הקצה והפעילו את מחמם הבמה בטמפרטורה של 37 °C. כדי להסיר שאריות של מצע EGM two MV והצטברות של מלחים, נגבו בזהירות את הצד התחתון של לבישת הכיסוי בעזרת נייר Kim wipe ספוג ב-70% ethanol, ולאחר מכן בעזרת נייר Kim wipe יבש. השאירו את תאי ה-HU שעברו טרנספקציה להשגחה (equilibrate) למשך 30 דקות.
נעלו את המיקוד. התמקדו באזור הנבחר של תרביות התאים לצורך המחקר. הגדירו את זמן החשיפה של המצלמה לבין 0.5 לשתיים שניות, בהתאם לעוצמת אות ה-GFP Act בתאים.
הגדירו גם את זמני המרווח והמשך עבור הניסוי. כעת, כאשר אורות החדר כבויים, צלמו תמונה בודדת כדי להעריך את ההגדרות. צלמו את סדרת צילומי השהיית הזמן (time lapse) תוך ניטור התמונות כפי שנדרש.
בפרוטוקול טיפוסי, השג 20 עד 30 דקות של תמונות בקו בסיס לפני הוספת חומר בדיקה, ולאחריהן 0.5 עד ארבע שעות של רכישת תמונות נוספות. לבסוף, כפי שפורט בטקסט הנלווה, העरक את מרחק הבליטה, ההתמדה והמהירות של ה-lamely podia באמצעות ניתוח גרף CH. בניסוי טיפוסי, GFP actin מובע ביותר מ-50% מה-VE שעברו טרנספקציה באופן אקראי.
תמונות אלה, שצולמו אחת לדקה, לכדו GFP actin לאורך הציטופלזמה, כמו גם במבנים סיביים וב-e meli podia מקומיים הבולטים לאורך קצה התא. עקביות המרחק והמהירות של בליטות התא מכומתים מתוך סדרות של תמונות time-lapse. באמצעות ניתוח chm graph, ראשית, נמתח קו של פיקסל בודד בניצב גס לקצה התא.
אזור זה מופק מכל תמונה בסט ה-time-lapse כדי ליצור מונטאז' של האזור לאורך זמן או גרף chime; כאן, מנקודת מבט משמאל לימין בגרף ה-chime, בליטות מיוצגות כתנועות כלפי מעלה בקצה התא. כאשר קו מונח על קצה אחת מהבליטות הללו, ניתן לאסוף את נתוני הפיקסלים הקשורים לאותו קו כדי לכמת את דינמיקת הבליטות. ניתן להשתמש במספר הכולל של הבליטות בגרף chm כדי להעריך את תדירות הבליטות.
ניתוח זה מתאר תנועות של סיבי מאמץ (stress fibers) שנוצרו סמוך להיקף התא ונעים לעבר מרכז התא, שם הם בסופו של דבר מתפרקים. בגרף ה-chio, סיבי המאמץ מופיעים כקווים רציפים באזור הציטופלזמה, לרוב בתנועה כלפי מטה וימינה לעבר מרכז התא. כאשר הסיבים קשים לזיהוי בגרף ה-chio המקורי, מסנן unsharp mask מחדד את התמונה; קווים המסומנים על גבי סיבי המאמץ מקלים על איסוף נתוני פיקסלים באמצעות פונקציית המדידה (measure). לחלופין, קווים הנמתחים מתחילתה ועד סופה של סיב מאמץ מזוהה, מספקים ממוצע נתוני פיקסלים למשך כל הזמן שבו נצפה הסיב.
מצגת זו הדגימה כיצד לנתח נתונים מסט תמונות של צילום רצף זמנים (time-lapse) באמצעות ניתוח גרפי עם תוכנות כגון Image J. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחקור את הדינמיקה של שלד התא מ-actin בתגובה למתווכי דלקת, תוך שימוש בדימוי תאי חיים של תאי אנדותל שעברו טרנספקציה.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לצפייה בשינויים דינמיים בשלד התא של אקטין בתאי אנדותל חיים באמצעות דימוי GFP-actin. טכניקה זו מאפשרת הערכה בזמן אמת של הדינמיקה של שלד התא בתגובה לגירויים שונים, ובכך מספקת תובנות לגבי מנגנוני חדירות האנדותל.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- טכניקות דימות
רקע
- תאי אנדותל ממלאים תפקיד מכריע בביולוגיה של כלי הדם.
- שלד האקטין חיוני לצורת התא ולניידותו.
- שיטות דימוי מסורתיות נכשלות לעיתים קרובות בלכידת תהליכים תאיים דינמיים.
- דימוי תאים חיים מספק הבנה מקיפה יותר של הדינמיקה של שלד התא.
מטרת המחקר
- לתצפית על ההתנהגות הדינמית של שלד התא האקטיני בתאי אנדותל חיים.
- להערכת ההשפעות של חומרים פרמקולוגיים על שינויים בשלד התא.
- לשיפור ההבנה של מנגנוני חדירות האנדותל.
שיטות שנ utilização
- טרנספקציה של תאי אנדותל של וריד טבילית אנושי (HUVECs) עם פלסמיד GFP-actin.
- גידול תאים על כיסויי זכוכית (cover slips) לצורך דימות.
- דימות במרווחי זמן (Time-lapse imaging) ללכידת דינמיקת השלד התאי לפני ואחרי טיפול.
- ניתוח של דינמיקת בליטות באמצעות תוכנת דימות.
תוצאות עיקריות
- דימוי בזמן אמת חשף שינויים משמעותיים בדינמיקה של actin בתגובה לגירויים.
- ניתוח כמותי הראה וריאציות במרחק הבליטה, בהתמדה ובמהירות.
- הבעת GFP-actin אושרה ביותר מ-50% מהתאים שעברו טרנספקציה.
- שינויים דינמיים בשלד התא תועדו ונותחו ביעילות.
מסקנות
- דימוי תאים חיים הוא כלי רב עוצמה לחקר דינמיקת השלד התאי.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של התנהגות תאי אנדותל תחת תנאים שונים.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל טכניקה זו כדי לחקור תהליכים תאיים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת ההתנהגות הדינמית של שלד התא המבוסס על אקטין בתאי אנדותל היא קריטית להערכת שלמות מחסום כלי הדם בתהליכי גילוי תרופות. דימות תאים חיים של GFP-actin מאפשר תצפית בזמן אמת על תגובות שלד התא למתווכי דלקת, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטית של טיפולים המכוונים לכלי דם. גישה זו מספקת תובנות ניבויות לגבי שינויים בחדירות האנדותל, המנחים החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) בשלב הפיתוח הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של דינמיקת actin בתאי אנדותל חיים בתנאי דלקת.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי קישור שינויים בשלד התא לשלמות הצומת (junctional integrity) ולתפקוד המחסום.
- ערך מדעי: תורם לביטחון במיקוד החזוי (predictive confidence) על ידי לכידה של ארגון מחדש תלוי-זמן של actin המתואם עם שינויים בחדירות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מודלים אנדותליאליים עשויים (validated) לסריקת תרכובות בהמשך, על ידי קביעת דינמיקת האקטין הבסיסית.
- ערך מדעי: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות ניתוח קימוגרף כמותי של מרחק הבליטה, ההתמדה והמהירות של הלמליפודיה.
- ערך מדעי: תומך במוכנות לסריקה על ידי אספקת תוצאות ה-time-lapse הניתנות לשחזור של תגובות השלד התאי לסוכנים פרמקולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה על ידי מידול תגובות של תאי אנדותל מווריד טביליות אנושי לגרויים דלקתיים.
- ערך מדעי: מבטיח המשכיות תרגומית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מדדים דינמיים וכמותיים של השלד התאי.
- ערך מדעי: מסייע בקבלת החלטות על התקדמות מותאמת סיכונים באמצעות זיהוי מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס פגיעה ושחזור של מחסום התאים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), באמצעות אספקת קריאות פנוטיפיות דינמיות של תגובות תאי אנדותל.
- ביולוגיית גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור נתיבים על ידי ויזואליזציה של lamellipodia עשירים באקטין ותחלופה של סיבי מאמץ (stress fibers) בתאים חיים.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות דימות time-lapse סטנדרטי וניתוח קיימוגרף של דינמיקת בליטות.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של מרחק, התמדה ומהירות של בליטות כדי לאפשר הערכה השוואית של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי מידול מנגנוני מחסום אנדותליאלי הרלוונטיים למחלות כלי דם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימות של תאים חיים לשימוש חוזר לצורך חקר דינמיקה של השלד התאי בסוגי תאים ובגירויים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במנגנוני חדירות אנדותל.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות מדדים כמותיים של השלד התאי הנגזרים מנתוני time-lapse.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת תובנות מוקדמות מבוססות-מנגנון לגבי רעילות כלי דם או אותות יעילות.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם-סיכון בהתבסס על השפעותיהן על דינמיקת האקטין האנדותליאלית ותפקוד המחסום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית תאי אנדותל, טרנספקציה וטכניקות של דימיון תאים חיים (live-cell imaging).
- תלוי במערכות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המסוגלות לביצוע רכישת תמונות בשיטת time-lapse ובקרת סביבה (37°C, פרפוזיה פיזיולוגית).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי רכישת תמונות ופרוטוקולים לניתוח קימוגרפים (kymograph) לצורך פרשנות עקבית של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת המודל לסוגים אחרים של תאי אנדותל או תאים שאינם אנדותליים.
- מוגבל על ידי יעילות הטרנספקציה ושונות בביטוי GFP-actin, אותן יש לכמת כדי להבטיח את אמינות הנתונים.
