PDMS ייצור המכשיר ושינוי פני השטח

שמי קן קוץ. אני פוסט-דוקטור כאן במרכז למשאבי Bio MAs המסונף לבית החולים הכללי של מסצ'וסטס. פרויקט המחקר המרכזי שלי כולל בידוד של נויטרופילים באמצעות התקן ללכידה באפיניות אימונית עם מבנים של מיקרופלואידיקה.

אנו משתמשים במכשיר זה בחמישה בתי חולים שונים ברחבי המדינה כדי לבודד RNA לצורך אנליזה גנומית המשך. באופן בסיסי, מה שיש בידיכם הוא שכבת מאסטר של SU8 photo resist על גבי סיליקון. אנו עומדים למזוג אלסטומר דו-רכיבי PDMS מעל המאסטר הזה, וה-PDMS יצור תבנית.

אנו מוציאים את תבנית המאסטר מהמארז שלה ומניחים אותה בתוך צלחת פטרי. המאסטר מקובע באמצעות סרט דביק לתחתית צלחת הפטרי. על המאזניים אנו שוקלים תערובת של PDMS, מקשה ושרף בסיס.

היחס הוא חלק אחד של מקשה ל-10 חלקים של שרף. בדרך כלל, עבור המכשירים שגזרנו, שוקלים 20 עד 30 גרם של השרף ושניים עד שלושה גרם של המקשה בהתאמה. לאחר מזיגת המקשה והשרף לתוך כלי שקילה קטן, אנו משתמשים במזלג פלסטיק סטנדרטי כדי לערבב ביניהם.

יש לוודא שהערבוב נעשה בעוצמה וכי התערובת נקיפלה אחת על השנייה כדי להבטיח שהממס (hardener) יתפזר באופן אחיד בתוך השרף. בדרך כלל, אנו עוקבים אחר איכות הערבוב של השניים. על ידי בחינת מספר בועות האוויר, אנו שואפים להגיע לפיזור אחיד של בועות אוויר קטנות בכל רחבי האלאסטומר.

לאחר מכן, אנו שופכים את ה-PDMS מעל תבנית ה-SU-8 שנמצאת בתוך פטריית השכבה. אנו מניחים את התבנית עם ה-PDMS מעליה בתוך פעמון ואקום, ומרוקנים את התא כדי להוציא את האוויר שערבבנו לתוכו. בדרך כלל, תהליך הוואקום אורך בין 30 דקות לשעה אחת.

לאחר ניתון הגזים, אנו מוציאים את ההתקנים מתא הוואקום ומניחים אותם בתנור בטמפרטורה של 65 עד 80 °C. זמן האשייה המינימלי בטמפרטורות אלו הוא שלוש עד שש שעות. במעבדה שלנו, אנו בדרך כלל משאירים את ההתקנים בתנור למשך הלילה.

בדרך כלל, אנו משתמשים בסכין ניתוח מפלדה מספר 11. אנו מבצעים חיתוכים ישרים לעומק של כחצי סנטימטר מקצה תבנית המאסטר הסיליקונית, וחותכים מסביב לקצה המאסטר ליצירת דיסק גדול. אנו מקלפים את תבנית ה-PDMS מהמאסטר ומניחים אותה כשצד התבליט פונה כלפי מעלה בתוך צלחת פטרי נקייה.

אנו מוציאים את התבנית המשוחררת מתוך צלחת הפטרי ומניחים אותה על משטח חיתוך באמצעות סכין או סכין המורכבת על מסילה ליניארית. אנו חותכים את ההתקנים המכילים את התבנית. לאחר מכן, כל התקן חתוך מוחזר לצלחת הפטרי להמשך עיבוד.

בדרך כלל, כדי לחבר את המכשירים שלנו לנוזלים, ננקב חורים במכשיר ה-PDMS. המכשיר שבו אנו משתמשים לניקוב החורים הוא מזרק סטנדרטי של 3 מיליליטר. בקצה המזרק של ה-3 מיליליטר נמצא מחט פלדת אל-חלד בעלת קצה קהה.

בתוך מחט הפלדה אל-חלודה נמצא תיל המתאים לקוטרה הפנימי של המחט. תיל זה מחובר לבוכנה של המזרק. על ידי משיכה של הבוכנה לאחור והסגת המחט, ניתן ליצור חור או להוציא פקק מה-PDMS. הפכו את התקן ה-PDMS והוציאו אותו על ידי לחיצה על הבוכנה.

הסוד בשימוש במכשירי ניקוב הוא לשמור על הבוכנה אנכית ככל האפשר ולא לסובב את מכשיר הניקוב כלל. כאשר מנקבים דרך ה-PDMS, מרימים את כל המכשיר, את כל מכשיר ה-PDMS, באמצעות פינצטה, הופכים אותו ומחלצים את הפקק על ידי לחיצה מטה על הבוכנה. תופסים את הפקק עם פינצטה ומשליכים אותו.

לאחר מכן, החזר את הבוכנה שוב, הפוך את המכשיר חזרה למטה והוצא את מכשיר החיתוך. חזור על פעולה זו עד שכל החורים ננקבו. עבור תהליך ההדבקה, אנו מדביקים את מכשירי ה-PDMS ללמיות זכוכית.

עבור המכשירים שלנו, אנו נבצע הדבקה בלתי הפיכה או חיבור קוולנטי של ה-PDMS למשקרי זכוכית. פעולה זו מבוצעת על ידי הנחתם בתוך plasma Asher וחשיפתם לפלזמה חמצונית ריאקטיבית. השלבים לביצוע פעולה זו הם לקיחת מכשיר ה-PDMS והנחתו על המגש של ה-plasma Asher.

כאשר מאפייני המכשיר פונים כלפי מעלה, ניתן להשתמש בכל זכוכית מיקרוסקופ סטנדרטית. אנו משתמשים בזכוכית מיקרוסקופ מוגדלת מעט, באורך one and a half inch, כדי להתאימה למכשיר שלנו. ניתן להשתמש בהן ישירות מהאריזה.

אנו מעדיפים לטפל בהם בתמיסת פיראנה. פעולה זו מנקה זיהומים אורגניים שעשויים להימצא על פני השטח של שקף הזכוכית. לאחר הנחת המכשיר ושקף הזכוכית על מגש ה-plasma Asher, החליקו את המגש אל תוך ה-plasma Asher וחשפו אותם לפלזמה חמצונית ריאקטיבית.

לאחר השלמת התוכנית במכשיר ה-plasma Asher, אנו פותחים את התא ומוציאים את הפלטה עם המכשירים שלנו אל משטח העבודה. באמצעות פינצטה, אנו מרים בזהירות את מכשיר ה-PDMS, תוך הקפדה לא לגעת במשטחי ההדבקה עם האצבעות. אנו הופכים את צד ההדבקה כלפי מטה על גבי הזכוכית, על גבי השקופית, ולאחר מכן אנו מוודאים שאין בועות אוויר בין ה-PDMS לשקופית הזכוכית.

אנו מניחים את התקן ה-PDMS, שכעת הוא מודבק לזכוכית, על פלטה חמה בטמפרטורה של 65 עד 75 °C למשך 10 דקות כדי להשיג קשר כימי חזק יותר. בחלק זה, אנו הולכים לשנות כימית את פני השטח של ה-PDMS והזכוכית; לאחר ההדבקה בחדר נקי, נותרנו עם פני שטח של PDMS שכוללים קבוצות OH רגיבות על פני השטח. אנו זקוקים למשטח רגיב זה, שהוא הידרופילי ובסופו של דבר יפרוץ אל תוך גוף ה-PDMS.

מכיוון שכימיה של פני השטח מבוצעת בצורה הטובה ביותר מיד לאחר טיפול בפלזמה, נשתמש בתמיסה של 5% של 3-mercaptopropyltrimethoxysilane. זוהי תמיסה של 5% לנפח, ובשורה התחתונה מה שאנו עושים הוא להזריק אותה לכניסה ולוודא שהמכשיר ממולא לחלוטין ללא בועות אוויר.

אם קיימות בועות אוויר, דחפו אותן החוצה באמצעות פינצטה. לאחר הזרקת ה-slan, המתינו 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. בדרך כלל, מזריקים נפח שני של slan כ-10 דקות לאחר תחילת התגובה.

לאחר שהסילן הגיב למשך כחצי שעה, נשטוף את כל המכשירים בשלוש עד ארבעה נפחי מכשיר של אתנול טהור. את העודפים שנשפכו פשוט נספוג עם ניגב כימי. לאחר שטיפת המכשירים, נרים אותם ונניח אותם על פלטה מחוממת, המכוונת ל-100 °C, ונאפשר לאתנול שנמצא שם להתאדות. תהליך זה מסייע בהשחזת פני השטח של הסילן.

לאחר שהמכשיר התייבש, ניתן לאחסן אותו במייבש למשך חודשים, או שניתן לקחת את המכשיר ולהמשיך מיד לשלב הבא. לאחר שהמכשירים עברו תהליך אשורה, הם עשויים כעת בציפוי sine הן על פני הזכוכית והן על פני ה-PDMS. ה-sine הוא capto sine עם קבוצת thiol, אשר תגיב עם ה-crosslinker ההטרו-ביפונקציונלי שלנו, שהוא GMBS.

הוא מדולל באתנול טהור. הוא מגיב עם מים, לכן יש להיזהר שלא לחשוף אותו לתנאים מימיים. אנו מזריקים אותו אל תוך המכשירים ומסירים בועות אוויר באמצעות פינצטה, כפי שאני עושה כאן, כדי להבטיח שכל המשטחים יהיו מצופים במולקולה זו.

אנו מכסים את הכלי ומשאירים אותו להגיב למשך חצי שעה. לאחר שה-GMBS הגיב במשך חצי שעה, נשטוף את המכשירים במים דיוניים כדי להסיר שאריות אתנול שנמצאות במכשיר. לאחר מכן, נזרים NeutrAvidin, שהוא חלבון קושר ביוטין.

לאחר מכן, ממהללים את ה-neutravain לריכוז של 10 µg/mL. אם הוזרק בטעות אוויר למכשיר, יהיה צורך לשטוף אותו שוב באתנול כדי להסיר ביעילות את כל האוויר; האתנול מרטיב טוב יותר את משטחי המכשיר ומאפשר להסיר בועות אוויר שהוכנסו למכשיר בטעות. ברגע שהמכשירים נשטפו במים דה-יוניזציה, נמלא בדרך כלל את המכשיר בשני עד ארבעה נפחי מכשיר של תמיסת neutravain מדוללת.

ה-Nutt travain יגיב עם ה-GMBS, המקובע למשטח באמצעות כל אמצעי ראשוני על ה-Nutt travain. תהליך זה יכול להתרחש בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. בדרך כלל, אני מניח את המכשירים בחדר קירור בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה.

עם זאת, לפני הוספת הנוגדן, ברצוננו לשטוף החוצה כל Aden שאינו קשור בתמיסה. אנו עושים זאת על ידי זרימה של תמיסת BSA בריכוז 1% המדוללת ב-PBS. מכיוון ששבבים אלו ישמשו לאנליזה גנומית בהמשך, כל התמיסות שבהן אנו משתמשים הן נקיות מ-RNA.

בדרך כלל, אנו שוטפים את המכשיר עם ארבעה עד חמישה נפחים של תמיסת 1%BSA. לאחר מכן, אנו מוסיפים את הנוגדן. הנוגדן בניסוי זה הוא CD 66 B, ונוגדנים ספציפיים לגראנולוציטים בדם מלא.

אנו משתמשים בריכוז שבין 10 ל-25 µg/mL, ונזריק את הנוגדן. נזריק 200 µL של נוגדן לכל מכשיר. נבצע שתי הזרקות של 100 µL, אחת לכל פתח במכשיר.

בדרך כלל, נזריק 100 µL לתוך פתח אחד, נמתין 30 דקות, ואז נזריק 100 µL נוספים לתוך הפתח הנגדי.