הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין אזורי סינפסה פעילים תרגומית מקליפת המוח של עכבר, באמצעות מדרג צפיפות סוכרוז לא רציף. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף והומוגניזציה של קליפות המוח של העכבר, ולאחר מכן על ידי סבוב של ההומוגנאט בצנטריפוגה. לאחר מכן, יש להעביר את ההומוגנאט שעבר צנטריפוגה, או את supernatant, למדרגי הסוכרוז שהוכנו מראש.

השלב הסופי הוא סבוב בצנטריפוגה ואיסוף של פראקציית הסינפטוזומים. בסופו של דבר, אנליזת western blot וניסויי שילוב של S 35 methionine מראים כי פראקציית הסינפטוזומים מועשרת בסינפסים ופעילה תרגומית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון סבוב בצנטריפוגה וסינון הם, ראשית, מניעת נזק מכני באמצעות שימוש במדרגי צפיפות, ושנית, רעילות נמוכה של per call כלפי התאים ומרכיביהם.

בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקשו בביצוע הפרוטוקול, כיוון שהתזמון ממלא תפקיד מרכזי. לאחר קציר הקורטיס, יש להשלים את הפעולה במהירות. כדי להתחיל את ההליך, הכינו את שכבות המדרג של 3%, 10%, 15% ו-23% על ידי הוספת כמויות SIP המתאימות, כפי שמתואר בכתב היד המצורף, לבאפר GM וערבבו היטב.

מזגו את שכבות המדרג על ידי פפיט של שני מיליליטרים מכל אחת מהתמיסות האיסו-אסמוטיות של perol בריכוזים של 15%, 10% ו-3% אל תוך מבחנות צנטריפוגה של Beckman עם מכסים. בעזרת פפיפט P 1000, יש לוודא שהממשק בין השכבות גלוי בבירור וללא ערבוב ביניהן. שמרו את המדרגים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות לפני השימוש.

לפני תחילת פרוצדורה זו, הכין תמיסות נחוצות נוספות כפי שמתואר בכתב היד המצורף. בצע המתנה לעכבר בגיל P 13 עד P 21 והכן אותו לניתוח על ידי ריסוס עורף הצוואר והראש ב-70% ethanol. לאחר מכן, השתמש במספריים חדות כדי לחתוך את השקע של חוט השדרה בבסיס הגולגולת.

בשלב הבא, הסירו את העור מחלקו העליון של הגולגולת. חתכו את הגולגולת באופן צדי בין העצם הפריאטלית לבין העצם האינטר-פריאטלית, או בין אזורי המוח הגדול לקורטקס. לאחר מכן, חתכו את הגולגולת מבסיסה לכיוון האף לאורך התפר הסגיטלי.

בשלב זה, הסיר בזהירות את עצם הפריאטלית הרכה על ידי משיכת כל המיספירה הצידה. לאחר מכן, הכנס את השפכטל לתוך המוח מעל המוח הקטן (cerebellum) כדי להוציא את הקורטקס. הנח אותו בבופר GM קר בקרח, וחזור על הפרוצדורות שוב כדי לאסוף קורטקסים נוספים.

כעת שטפו את קליפות המוח בבופר GM קר בקרח. לאחר מכן, העבירו שתי קליפות מוח להומגניזר מסוג glass down המכיל חמישה מיליליטרים של בופר GM קר. בצעו הומוגניזציה עדינה של קליפות המוח באמצעות חמישה עד 10 תנועות של פסטל A (הפסטל הרפוי), ולאחר מכן חמישה עד 10 תנועות של פסטל B (הפסטל הצפוף).

מספר הפעולות משתנה בהתאם למכשיר ההומוגניזציה האינדיבידואלי. העבירו את ההומוגנאט לפרועת קונית בנפח 15 milliliter. סבבבב את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 1000 times.

סבב בצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C במכשיר Allegra six KR כדי לשקע פסד פסד תאי וגרעינים. שכבדו 2 mL של הנוזל העליון (supernatant) על גרדיאנט סוכרוז עבור כל דגימה, כאשר גרדיאנט אחד מיועד לכל קורטקס שלם, וסגרו את המבחנות בפקקים. לאחר מכן, סובבו אותן ברוטור בזווית קבועה ב-32,500 ×g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 °C בצנטריפוגה מסוג Beckman J 2 21.

בסיום התהליך, תוך שימוש במתאמים מתאימים, המדרג צריך להניב פס SN חזק; יש לשאוב ולהשליך את התמיסה שמעל פס ה-SN. באמצעות פיפטת פסטור מזכוכית, יש לשאוב את פס ה-SN בממשק שבין 15% ל-23%; מדרג אחד מניב בדרך כלל כ-0.9 עד 1.1 milliliters של sns. לאחר מכן, יש להעביר את התוצר למבחנה קונית ולאחסנו על קרח.

לאחר מכן, התאימו את ריכוז המלח של ה-SNS על ידי הוספת נפח של 1/10 מבuffer גירוי בריכוז פי 10. באופן רבנתי, ניתן להוסיף calcium chloride בריכוז פי 1000 כדי להגיע לריכוז סופי של 12 nano molar. לאחר מכן, הוסיפו מאגר TTX בריכוז 1 millimolar כדי להגיע לריכוז סופי של 1 micromolar, למשם דיכוי עירור לא ספציפי.

השלב הבא הוא שימוש ב-SNS באפליקציה רלוונטית בהמשך התהליך, כגון מחקרים של תרגום חלבונים. עבור אפליקציות אחרות, ניתן לנקות או לרכז את הליזאט מה-SN באמצעות ערכת ה-Pierce SDS page sample prep. ניתן לקבוע את ריכוז החלבון ב-SNS באמצעות ערכת micro BCA protein assay.

הוצגו כאן שש רצועות או פראקציות. כאשר קליפת המוח של העכבר עברה הומוגניזציה והפרדה במדרגי סוכרוז פרול לא רציפים, ה-SNS המועשרים נמצאו ברצועה חמש בממשק שבין 23% ל-15%; רצועה זו הוסרה ונבדקה באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית. דוגמה של שלפוחיות סינפטיות שלמות ושימור של אלמנטים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים מוצגים כאן ב-western blot.

עלייה במסמנים סינפטיים וירידה בזיהומים בפס ה-SN מגרדיאנט סוכרוז לא רציף מוכיחות כי העלייה בהטמעה של S 35 methionine עם הוספת גלוטמט נובעת מסנתזת חלבונים דה-נובו (de novo). הוספו 40 micromolar anesa mycin, מעכב סנתזת חלבונים. דמות זו מראה ירידה ניכרת בהטמעת S 35 methionine בנוכחות anso mycin, עם או בלי גלוטמט, בהשוואה לרמות הבסיס.

כך, מדרגי סוכרוז (sucrose gradients) לא רציפים של percoll מייצרים במהירות SNS פעיל מאוד וטהור יחסית שניתן להשתמש בו לחקר תרגום חלבונים. איור זה מראה כי פס 5 מהמדרג הלא רציף של percoll sucrose מכיל את הרמות הגבוהות ביותר של סינתזת חלבונים דה-נובו (de novo). ה-SNS שהוכן על ידי העברת קורטקס הומוגניזד דרך סדרה של מסננים בעלי גודל נקבים פוחת ולאחר מכן צנטריפוגה על מדרג percoll sucrose לא רציף לצורך השוואה, מכיל יותר ממברנות שבורות ופחות SNS שלם מאשר SNS שהוכן בשיטת מדרג ה-percoll sucrose הלא רציף. נראה כי SNS שהוכן בשיטת מדרג ה-percoll sucrose הלא רציף מכיל פעילות סינתזה של חלבונים דה-נובו גבוהה יותר מאשר SNS שהוכן בשיטת הסינון.

נמצא כי SNS שהוכן מעכברים צעירים בעל פעילות תרגומית רבה יותר מאשר מעכברים מבוגרים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבודד אזורים סינפטיים עצביים (synaptic neuro zones) פעילים תרגומית על ידי הומוגניזציה של קורטקס עכברים, סבוב של ההומוגנאט ברוטור מסוג swinging bucket, סבוב של העילאי מעל מדרג סוכרוז פרקולרי ברוטור בזווית קבועה, ולאחר מכן איסוף של פס האזורים הסינפטיים העצביים שהתקבל.