שיווי משקל ניטור שינויים ב-RNA על ידי מבנה 'Peroxidative' ו 'חמצוני "footprinting רדיקלי הידרוקסיל

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע כיצד מולקולות RNA מתקפלות באמצעות שיטת טביעת מאפה (footprinting) של רדיקלי הידרוקסיל. זאת מושג על ידי סימון קצוות, טיהור בג'ל וקיפול מקדים של ה-RNA, המבטיחים את שלמות המבנה של ה-RNA לפני הקיפול המתווך על ידי מגנזיום; בשלב הבא, מערבבים את ריאגנטי פנטון (Fenton reagents) כדי ליצור רדיקלי הידרוקסיל, אשר יכולים לאחר מכן ל 끊ו את שלד ה-RNA בהתאם לנגישותו לממס. לאחר מכן, תוצרי הפירוק של ה-RNA מופרדים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד דנטורטי, ומדגמיים באמצעות רדיוגרפיה עצמית.

האינטגרלים של הפסים מכומתים באמצעות תוכנה לניתוח footprinting חצי-אוטומטי. המטרה הסופית היא להפיק איזותרמות קיפול המשקפות התגשמות של מבנה שלישוני של RNA. הדבר מושג על ידי נרמול האינטגרלים של הפסים לרוויה חלקית.

ניתן להתאים לאחר מכן את האיזותרמות למשוואת היל (hill equation). היתרון המרכזי של טביעת רגל הידרוקסית (hydroxy footprinting) הוא קבלת מידע על המבנה השלישוני של RNA באמצעות כימיקלים זולים; בשל הפעילות הגבוהה ובשל גודלן הקטן, רדיקלי הידרוקסיל הם גששים (probes) מושלמים להבחנה בין נוקלאוטידים נגישים לממס לבין נוקלאוטידים קבורים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית של RNA.

לדוגמה, כיצד ריבוזומים משתמשים ביוני מתכת כדי להגיע לקונפורמציה הפעילה שלהם? ניתן להשתמש בטביעת רגל של רדיקלי הידרוקסיל כדי להבין את יסודות הספציפיות והזיהוי של RNA. בנוסף לחשיפת מידע על המבנה השלישוני של RNA, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע את אתרי קישור החלבון המדויקים במולקולות RNA או DNA.

האתגרים המרכזיים בשיטה זו הם מניעת פירוק הדגימה על ידי ריבונוקלאז ואופטימיזציה של ריכוז הברזל כדי להשיג את הכמות הנכונה של שבירת RNA. כמו כן, ניתוח מפורט של מרווחי הפסים עלול להיות מורכב למדי. התועלת המרכזית של סרטון זה היא לסייע לצופים להבין את שלבי התכנון ואת הביצוע המוצלח של ניסוי טביעת רגל של רדיקלי הידרוקסיל. לפני תחילת פרוטוקול זה, הכינו את כל ריאגנטי הטביעה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

כסרט המלווה לסרטון זה, ניתן להפיק RNA באמצעות DFOs ארבעה קרובי ומסומנים בקצה כפי שמתואר שם. טהרו את ה-RNA המסומן רדיואקטיבית באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל דה-נטורינג. השגיו את ה-RNA המטוהר באמצעות שתי חילוצי ג'ל עוקבים תוך שימוש בנתרן אצטט 0.3 molar.

לאחר מכן, השקיפו את ה-RNA על ידי ערבוב של 0.5 milliliters של התמיסה המימית עם מיליליטר אחד של ethanol. דגרו את התערובת למשך דקה אחת על קרח יבש. לאחר סבב של הדגימה בצנטריפוגה, השליכו את הנוזל העליון. שטפו את משקע ה-RNA עם 70% ethanol.

הסיר את העילוי לאחר צנטריפוגה נוספת ויבש את המשקע בוואקום. לאחר מכן, המס את דגימות ה-RNA המזוהות ב-P 32 המpurified. העבר בפיפט 30 µL של תמיסת ה-RNA אל תוך מבחנה חדשה המכילה 330 µL של תמיסת תגובה בריכוז פי 1.

שקיעו את ה-RNA באמצעות אתנול ולאחר מכן ייבשו את המשקע בוואקום. לאחר הייבוש, ניתן להשתמש במשקע זה ליצירת סולם הייחוס כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. דנטורו את תמיסת ה-RNA המבופרת שנותרה על ידי חימום ב-95 degrees Celsius למשך שתי דקות. קררו את הדגימות לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ולאחר מכן בצעו סבוב קצר (quick spin) כדי להחזיר את התוצרי המ 응בנה לתמיסה. כדי להתחיל בניסוי טביעת הרגל (footprint experiment), הכינו 27 מבחנות תגובה עבור מספיק דגימות למילוי ג'ל אלקטרופורזה בעל 30 בארות.

לאחר הכללת סולמי המדדים והבקרת הפיסול, קבעו את ריכוזי המגנזיום והברזל הסופיים כך שיהיו מרווחים באופן שווה בסקלה לוגריתמית על פני מספר סדרי גודל סביב נקודת האמצע של הטיטרציה; הכנת יוני המגנזיום בבופר תגובה בריכוז פי 1 מתוארת בטקסט בנפרד. דגרו את ה-RNA ואת תמיסות יוני המגנזיום בטמפרטורה של 50 °C למשך חמש דקות. לאחר מכן, ערבבו 10 µL של תמיסת ה-RNA עם 90 µL מהכמות המתאימה של תמיסת המגנזיום והברזל.

כדי להגיע לנפח סופי של 100 µL, דגרו כל תערובת למשך 30 דקות בטמפרטורה של 50 °C. לאחר מכן, אפשרו לתמיסות להגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 25 °C למשך שעה אחת, בזמן שמתקיים קיפול של ה-RNA. במקביל, מיד לפני תחילת התגובה של טביעת מאבק (footprinting) של רדיקלי הידרוקסיל, הכינו את תערובת תגובת הביקורת כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

הכינו את תגובת הפרוקסידציה על ידי טפטוף של שתי טיפות בנפח 2 µL לכל אחת של iron EDTA, sodium ascorbate ו-hydrogen peroxide בחלק העליון הפנימי של מבחנת התגובה המכילה את תמיסת ה-RNA, כך שהטיפות לא יגעו זו בזו. התחילו את תגובת ה-footprinting באמצעות ערבוב נמרץ. לאחר 15 שניות, עצרו את התגובה על ידי הוספה של 300 µL של ethanol קר ונקי.

סובבו את המבחנות שלוש עד חמש פעמים. לבסוף, השקיפו, שטפו ויבשו את המשקע כפי שבוצע קודם לכן. כחלופה לתגובה הפרו-חמצונית, תגובת הידרוקסיל חמצונית תבוצע על ידי הוספה של 5 µL מתערובת תגובת פנטון (Fenton) שהוכנה זה עתה לדגימות. הדגירו את התגובה החמצונית למשך 30 דקות בטמפרטורה של 25 °C.

לאחר מכן, הוסיפו 300 µL של אתנול קר טהור כדי לעצור את התגובה (quench) וערבבו על ידי סיבוב המבחנות. שוב, בצעו שקיעה. שטפו ויבשו את המשקע עם סיום התגובה הפרו-חמצונית או החמצונית.

המיסו את כופתי ה-RNA המיובשות ב-8 µL של צבע טעינה לג'ל מסוג שני. ודאו כי ה-RNA המסומן ב-P 32 הושעה מחדש באמצעות מונה גייגר. הכינו ג'ל ריצוף פוליאקרילאמיד דנטורטי בריכוז 8% בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. בעזרת מסרק בעל 30 בארות, העמיסו את הדגימות, כולל שתי דגימות ייחוס ובקרה של RNA מנוגמר.

הפרידו את מקטעי ה-RNA בהספק של 60 עד 75 ואט למשך שעתיים וחצי. חשפו את הג'ל המיובש למסך פוספורי לאחסון למשך לילה. סרקו את המסך הפוספורי באמצעות מערכת הדמיה לאוטורדיוגרפיה ללא סרט.

לאחר מכן, העבירו את קובץ תמונת הג'ל למחשב לצורך ניתוח. כדי להתחיל בניתוח הנתונים, פתחו את תוכנת Safa, שהיא תוכנה בקוד פתוח להתאמה וכמתית של פס בודד. טענו את רצף ה-RNA כקובץ TXT, ולאחריו את תמונת הג'ל כקובץ gel.

הגדירו את הנתיבים וכוונו את עוצמת הפסים. לאחר מכן, בחרו נתיב עיגון ובצעו יישור ג'ל שבו השמת הפסים לנוקליאוטידים מתבצעת ביחס לסולם עיכול ה-RNAs T one. כמותו את עוצמות הפסים והשתמשו בתכונת גרף הצבע/נרמול (normalization slash color plot) כדי לנרמל ולהקצות שאריות פוטנציאליות בלתי משתנות.

שמור את הפלט כקובץ txt. תוכנת ה-SFA מפיקה גיליון אלקטרוני המכיל עמודות, המייצגות את הנתיבים (lanes) על הג'ל, ושורות המייצגות את האינטגרלים של הרצועות הבודדות המתאימות למקטע ה-RNA. ראשית, יש לזהות את אתרי ההגנה המראים שינוי ניכר בנגישות לממס על ידי השוואת פרופיל ההגנה שהתקבל מדגימת ה-no magnesium ion לפרופיל של ריכוז ה-magnesium ion הסופי.

ככל שהערך נמוך יותר, כך הנוקלאוטיד מוגן יותר מפני התקפה של רדיקלי הידרוקסיל, ולהפך. לאחר מכן, צרו עקומות מעבר של עוצמות פס של נוקלאוטידים בודדים או קבוצות של נוקלאוטידים לעומת ריכוז מגנזיום-ברזל באמצעות פורמט של גיליון אלקטרוני; נרמלו את המעברים הללו באופן פרטני לפונקציית רוויה חלקית כפי שמתואר בחלק הטקסטואלי של פרוטוקול זה. כשלב סופי, התאימו את הנתונים למשוואת היל (hill equation).

ניתוח זה מנרמל את המעבר לרוויה חלקית, קובע את נקודת האמצע של המעבר ומספק בדיקה פנומנולוגית לבחינה האם המעבר המוצג הוא סיגמואידי. להלן תוצאות מייצגות מניסויי טביעת מאפה של רדיקלי הידרוקסיל ב-P four P six RRNA. איזותרמות הופקו מגילי ריצוף שנותחו על ידי Safa ולאחר מכן הותאמו כפי שמתואר בסעיף הניתוח.

תמונת הג'ל מעידה כי פיצול הרקע הוא מינימלי וכי השמה של נוקלאוטיד בודד היא אפשרית הודות לפס들 מוגדרים היטב בנתיב ה-T. פרגמנטציה של RNA המושראת על ידי רדיקלי הידרוקסיל גבוהה משמעותית מהרקע. המעבר מריכוז נמוך לגבוה של יוני מגנזיום קשור באופן סלקטיבי לירידה בעוצמה של פס들 בודדים וקבוצות של פס들, מה שמעיד על היווצרות RNA.

הגנה על מבנה שלישוני (Tertiary structure protection) מתייחסת לנוקלאוטיד בודד או לקבוצות של נוקלאוטידים סמוכים ששברים בהם משנים במקביל את עוצמות הפסים, המכומתות ומנורמלות באמצעות ניתוח saffer. הפלט הוא תרשים תרמי המציג באופן ויזואלי את מידת ההגנה מפני רדיקלי הידרוקסיל. מעבר הצבעים מתאר את השינוי בנגישות בעקבות הוספת מגנזיום-ברזל; מעבר מלבן לאדום מעיד על נוקלאוטידים נגישים יותר, בעוד שמעבר מלבן לכחול מעיד על נוקלאוטידים מוגנים יותר.

כל דרגה של הצללה משויכת לערך מספרי, אותו ניתן להשריש כעקומת הגנה ולנתח באמצעות מודל קישור כגון משוואת היל (hill equation). בדוגמה זו, קבוע הדיסוציאציה במצב שיווי משקל המשויך להגנה 1 5 3 עד 1 5 5 הוא בערך כפול מהערך התואם להגנה 1 6 3 עד 1 6 4. ניסוי טביעת רגל של רדיקלי הידרוקסיל זה יכול להסתיים תוך יום וחצי אם הוא מבוצע כהלכה.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור ללבוש כפפות וחלוק מעבדה כדי למנוע זיהום של RNAs. כמו כן, ריכוז הברזל הסופי תלוי במערכת הניסיונית. לכן, אנו ממליצים לבצע ניסוי תגובה למינון לפני ביצוע הפוטפרינטינג (footprinting) בהתאם לפרוצדורה זו.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון טביעת רגל של רדיקלי הידרוקסיל ברזולוציית זמן, על מנת לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, באיזו נקודת זמן קריטית מגיעים מולקולות RNA למבנה פעיל או למבנה מקופל באופן שגוי לאחר התפתחותן? טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה המבנית לחקור אינטראקציות שלישוניות של חומצות גרעין, הן במצב יציב והן במצבים ביניים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו קובעים היווצרות מבנה שלישוני של מולקולות RNA. זכרו כי שלבים מסוימים כרוכים בחומרים מסוכנים, ולכן מומלץ לנקוט באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות והרכבת משקפי מגן, וכן שימוש במגני פרספקס (plexiglass) בעת ביצוע פרוצדורה זו.